發(fā)布時間：2017-09-22 11:24

  本文關(guān)鍵詞：微創(chuàng)采血結(jié)合多色流式細胞術(shù)分析小鼠外周血記憶T細胞亞群

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【摘要】：目的為實現(xiàn)序貫多時間連續(xù)采血監(jiān)測小鼠外周血記憶T細胞亞群的變化情況,建立并優(yōu)化微創(chuàng)采血結(jié)合多色流式細胞術(shù)分析的方法體系。方法經(jīng)隱靜脈進行微創(chuàng)采血,使用熒光補償微球進行多色熒光補償矩陣的建立,在BD Calibur雙激光流式細胞儀上分析小鼠外周血記憶T細胞亞群(初始T細胞、中心記憶T細胞、效應(yīng)記憶T細胞),評估采血體積、全血是否離心、抗體孵育濃度、紅細胞裂解后是否洗滌等參數(shù)對多色流式分析結(jié)果的影響。隨后采用優(yōu)化的流式細胞分析方法動態(tài)評估C57和動脈粥樣硬化(AS)易發(fā)載脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)小鼠在從常規(guī)飲食切換至高脂飲食過程中記憶T細胞的演變過程。結(jié)果 (1)經(jīng)小鼠隱靜脈可實現(xiàn)10~50μL采血,該采血可無需對實驗動物進行麻醉,能夠?qū)崿F(xiàn)多次重復(fù)采血,且10μL全血即可滿足多色流式細胞術(shù)分析的需要,并減少抗體用量。(2)聯(lián)合高速離心分離血細胞進一步縮小抗體孵育體積,則可進一步節(jié)省抗體的用量。(3)對抗體濃度的優(yōu)化能在保證檢測結(jié)果準確性和可重復(fù)性好的基礎(chǔ)上進一步降低抗體用量和背景熒光的干擾。(4)紅細胞裂解后加用洗滌可進一步降低背景熒光,但延長操作時間;也可裂解后直接上機檢測。(5)使用上述流式細胞學(xué)分析方法揭示:apoE-/-小鼠在常規(guī)飲食基線水平其體內(nèi)的效應(yīng)記憶T細胞水平即高于對照C57小鼠(P0.05),給予高脂飲食3周后基本達到平臺,而C57小鼠在高脂飲食2周即達到平臺,表明apoE-/-小鼠在AS斑塊進展早期即出現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)紊亂。結(jié)論采用隱靜脈采血結(jié)合優(yōu)化流式細胞術(shù)抗體孵育流程可實現(xiàn)序貫連續(xù)采血,完成對小鼠體內(nèi)記憶T細胞亞群的動態(tài)觀察。
【作者單位】： 第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院心血管內(nèi)科;
【關(guān)鍵詞】： 微創(chuàng)采血 流式細胞術(shù) 外周血 記憶T細胞
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81130065,81072981,30971101,31171130,30900528) 上海市浦江人才計劃(D-15) 上海市基礎(chǔ)研究重點項目(10411956500) 上海市國際合作項目(10410701700)~~
【分類號】：R392.12
【正文快照】： 記憶T細胞是一類廣泛參與免疫應(yīng)答調(diào)控的免疫細胞,主要包括初始T細胞(naive T cells,Tna-ive)、中心記憶T細胞(central memory T cells,Tcm)和效應(yīng)記憶T細胞(effector memory T cells,Tem)三個亞群[1],其中Tnaive細胞在受到樹突狀細胞提呈的抗原刺激后分化為Tcm,后者被認為與

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1 陳李華;黃象謙;吳琳;黃^，

本文編號：900541