本文關(guān)鍵詞：NOX2介導(dǎo)楊梅苷抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)

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【摘要】：目的:以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞為實驗對象,在LPS誘導(dǎo)下,體外實驗觀察楊梅苷對NOX2來源的ROS活化介導(dǎo)JAKs/STAT1信號通路所致炎癥反應(yīng)的影響;同時,體內(nèi)實驗觀察楊梅苷在LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷中的作用,從而探討楊梅苷在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抗炎作用的分子機制。方法:運用CCK-8法檢測楊梅苷對RAW264.7細(xì)胞是否有毒性。在楊梅苷安全劑量范圍內(nèi),運用Western blotting和RT-PCR檢測楊梅苷對LPS誘導(dǎo)下i NOS和COX-2表達(dá)水平的影響,并確定楊梅苷的有效抗炎劑量范圍。ELISA法檢測楊梅苷在LPS誘導(dǎo)下促炎癥因子TNF-α、IL-6、MCP-1、NO和PGE2含量變化的影響。Western blotting檢測LPS誘導(dǎo)下MAPKs和JAKs/STATs信號通路活化時間以及楊梅苷對其活化的影響。激光共聚焦顯微鏡及EMSA實驗觀察楊梅苷對LPS誘導(dǎo)下STAT1蛋白的核轉(zhuǎn)位以及其轉(zhuǎn)錄活性的影響。運用JAK抑制劑Ruxolitinib證實JAK-STAT信號通路與炎癥介質(zhì)以及促炎癥因子之間的關(guān)系。運用活性氧探針檢測楊梅苷對LPS誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的影響,并運用ROS抑制劑NAC證實ROS同JAK-STAT信號介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)之間的關(guān)系。Western blotting與激光共聚焦顯微鏡分別觀察楊梅苷對LPS誘導(dǎo)下NOX2膜亞基gp91~(phox)和胞質(zhì)亞基p47~(phox)在胞質(zhì)和質(zhì)膜的分布情況變化。運用NOX抑制劑Apocynin證實NOX來源的ROS在JAK-STAT信號介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中的調(diào)控作用,并分別構(gòu)建針對NOX2亞基gp91~(phox)和p47~(phox)表達(dá)的sh RNA干擾質(zhì)粒載體,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,并驗證其干擾效果,證實干擾gp91~(phox)和p47~(phox)表達(dá)后,對LPS誘導(dǎo)下ROS,p-JAK1,p-JAK2,p-STAT1,i NOS和COX-2的影響。構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的小鼠急性炎癥性肺損傷模型,使用HE染色法觀察楊梅苷對小鼠急性肺組織損傷的影響。結(jié)果:楊梅苷僅在500μg/ml時對RAW264.7細(xì)胞活力產(chǎn)生抑制作用,并在安全劑量范圍內(nèi)抑制LPS誘導(dǎo)的i NOS的蛋白及m RNA的表達(dá),與此同時,楊梅苷對LPS誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)無影響,并且我們選擇100、200、400μg/ml楊梅苷作為抑制炎癥作用的低、中、高劑量組。楊梅苷抑制LPS誘導(dǎo)相關(guān)促炎癥因子TNF-α、IL-6、MCP-1、NO和PGE2的釋放與產(chǎn)生。LPS刺激RAW264.7細(xì)胞pERK,p-JNK,p-P38的最大活化點為30 min左右,p-JAK1及p-JAK2的最大活化點在10 min左右,而p-STAT1,p-STAT3的最高活化點在4 h左右。楊梅苷下調(diào)LPS誘導(dǎo)的p-JAK1,p-JAK2及p-STAT1的活化而對MAPKs及p-STAT3無影響,并且楊梅苷可以抑制LPS誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子STAT1轉(zhuǎn)位入核及其轉(zhuǎn)錄活性。楊梅苷抑制LPS誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,并可以阻斷LPS誘導(dǎo)下p47~(phox)亞基向質(zhì)膜的募集,使其與gp91~(phox)亞基發(fā)生聚合受阻,從而阻斷ROS的來源。與此同時,LPS對p47~(phox)亞基和gp91~(phox)亞基的表達(dá)并無影響。楊梅苷的抗炎作用是通過調(diào)控NOX2來源的ROS介導(dǎo)的JAKs/STAT1信號通路活化產(chǎn)生的。干擾NOX2的gp91~(phox)和p47~(phox)的表達(dá)可以有效阻斷LPS誘導(dǎo)下ROS累積,JAK1,JAK2,STAT1的活化及i NOS,COX-2的產(chǎn)生。結(jié)論:1)楊梅苷在無細(xì)胞毒性劑量范圍內(nèi)抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)及改善小鼠急性肺損傷。2)楊梅苷抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞促炎癥因子和炎癥介質(zhì)i NOS,NO,IL-6,TNF-α以及MCP-1的釋放,而對COX-2及PGE2的釋放無影響。3)楊梅苷抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)是通過阻斷JAKs/STAT1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來介導(dǎo)的,而對LPS誘導(dǎo)的MAPKs信號的活化無影響。4)NOX2來源的ROS是楊梅苷抑制LPS誘導(dǎo)的JAKs/STAT1依賴性炎癥的作用靶點。5)楊梅苷通過阻斷NOX2亞基p47~(phox)和gp91~(phox)的聚合從而下調(diào)ROS的產(chǎn)生。
【關(guān)鍵詞】：楊梅苷 脂多糖 RAW264.7細(xì)胞 JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 活性氧 NOX2
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R364.5
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-17
• 材料與方法17-31
• 結(jié)果31-62
• 1 楊梅苷對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響31-44
• 1.1 楊梅苷對RAW264.7 細(xì)胞活力的影響31
• 1.2 楊梅苷對LPS誘導(dǎo)的iNOS和COX-2 蛋白水平及其mRNA水平的影響31-33
• 1.3 楊梅苷對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中促炎癥因子釋放的影響33-35
• 1.4 LPS對RAW264.7 細(xì)胞MAPKs及JAKs/STAT1信號活化的影響35-37
• 1.5 楊梅苷對LPS誘導(dǎo)的JAK2/STAT1信號和MAPKs的影響37-39
• 1.6 楊梅苷對LPS誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子STAT1核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性的影響39-42
• 1.7 阻斷JAK-STAT信號通路對促炎癥因子表達(dá)的影響42-44
• 2 楊梅苷對胞內(nèi)NOX2來源的ROS調(diào)控下游的炎癥信號的影響44-60
• 2.1 楊梅苷對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)源性ROS的蓄積的影響44-45
• 2.2 阻斷ROS對JAK-STAT級聯(lián)信號介導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)的影響45-46
• 2.3 LPS對p47~(phox)和gp91~(phox)的表達(dá)的影響46-48
• 2.4 楊梅苷對p47~(phox)從胞質(zhì)向胞膜募集的影響48-50
• 2.5 阻斷NOX家族對JAKs/STAT1信號介導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)的影響50-54
• 2.6 沉默p47~(phox)和gp91~(phox)對LPS誘導(dǎo)的ROS-JAKs/STAT1-iNOS級聯(lián)炎癥反應(yīng)的影響54-60
• 3 楊梅苷對Balb/c小鼠氣管暴露LPS誘導(dǎo)的炎癥性肺損傷的影響60-62
• 討論62-68
• 結(jié)論68-69
• 下一步研究計劃69-70
• 參考文獻(xiàn)70-76
• 綜述76-93
• 參考文獻(xiàn)86-93
• 作者簡介及讀研期間主要科研成果93-94
• 致謝94

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本文編號：806107