本文關(guān)鍵詞：環(huán)鳥苷酸（cGMP）兔單抗的制備及競爭ELISA測定方法的建立

  更多相關(guān)文章： cGMP 單克隆抗體 酶聯(lián)免疫吸附測定 兔

【摘要】：環(huán)鳥苷酸(Guanosine 3',5'-cyclic monophosphate, cGMP)和環(huán)腺苷酸(Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate, cAMP)是細(xì)胞內(nèi)的第二信使,是原核生物和真核生物中重要的信號(hào)通路分子。cGMP對細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑產(chǎn)生影響。cGMP可以降低心肌代謝,收縮力和功能,參與干細(xì)胞的增殖與分化,抑制糖異生以及興奮副交感神經(jīng)。cGMP對視覺信號(hào)傳導(dǎo)、平滑肌和骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)功能、血小板活化、骨生長等的調(diào)節(jié)起到非常重要的作用。20世紀(jì)70-80年代,競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合分析法和放射性免疫分析法是檢測cGMP的主要方式。但由于放射性免疫分析法對人體有潛在危害,目前已逐步被以兔多抗或鼠單克隆抗體為關(guān)鍵試劑的酶標(biāo)記法和熒光ELISA法取代。多克隆抗體制備的ELISA試劑盒具有批次間差異大和特異性差的問題,鼠單克隆抗體制備的ELISA試劑盒無上述缺點(diǎn),但不同cGMP濃度間的吸光度值相差非常小,使用者難以得到可重復(fù)性的檢測數(shù)據(jù)。本研究采用SMCC等偶聯(lián)劑將cGMP偶聯(lián)于載體匙孔血藍(lán)蛋白(KLH),形成結(jié)合抗原cGMP-KLH。通過ELISA方法進(jìn)行偶聯(lián)鑒定,確認(rèn)cGMP已經(jīng)連接到載體蛋白上。用cGMP-KLH作為免疫原免疫新西蘭白兔。將兔子脾細(xì)胞與240E骨髓瘤樣細(xì)胞株融合,得到能夠分泌cGMP抗體的雜交瘤細(xì)胞株。通過間接ELISA和間接競爭ELISA方法,選取特異性最好的克隆進(jìn)行亞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng),收集上清并采用Protein A親和柱純化。采用OD280以及fortebio兩種方法測定純化后的兔單抗IgG濃度。分別采用直接ELISA和競爭ELISA法測定抗cGMP兔單抗的效價(jià)和特異性。通過檢測抗cGMP兔單抗與載體蛋白(BSA、KLH)的反應(yīng),顯示cGMP兔單抗不識(shí)別載體蛋白。所制備的cGMP兔單抗的效價(jià)為3.1 ng/mL,50%抑制濃度(IC50)為12.57 ng/mL。檢測抗cGMP兔單抗與cAMP、環(huán)磷酸肌苷(cIMP)、環(huán)單磷酸胞苷(cCMP)、單磷酸腺苷(AMP)、腺苷-5’-二磷酸(ADP)、5’-三磷酸腺苷(ATP)、鳥苷-5’-單磷酸(GMP)、5’-鳥苷二磷酸(GDP)、5’-三磷酸鳥苷(GTP)的交叉反應(yīng)性,根據(jù)交叉反應(yīng)率(Cross reaction,CR)判定cGMP兔單抗對cIMP有33.1%交叉反應(yīng)性,與其他結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)率均小于1.2%。說明cGMP兔單抗具有很高的特異性。對相關(guān)條件進(jìn)行優(yōu)化,得到競爭ELISA最佳反應(yīng)條件為：cGMP兔單抗最佳工作濃度為0.2μg/mL;cGMP-HRP的最佳的工作濃度為1：100稀釋。應(yīng)用競爭ELISA方法建立了檢測cGMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其檢測范圍為1.95-120 ng/mL,最低檢測限為1.95 ng/mL,回收率為89%-103%,批次內(nèi)和批次間的精密度分別小于11.68%和13.85%。
【關(guān)鍵詞】：cGMP 單克隆抗體 酶聯(lián)免疫吸附測定 兔
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392-33
【目錄】：

• 致謝4-5
• 主要縮略詞5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-14
• 第1章 緒論14-23
• 1.1. 環(huán)鳥苷酸的研究進(jìn)展14-21
• 1.1.1 CGMP的結(jié)構(gòu)14-15
• 1.1.2 CGMP的產(chǎn)生與分解15-17
• 1.1.3 CGMP信號(hào)通路的作用機(jī)制17-19
• 1.1.3.1 激活蛋白激酶G(PKG)18
• 1.1.3.2 調(diào)控CNG離子通道18-19
• 1.1.3.3 調(diào)節(jié)磷酸二酯酶(PDEs)活性19
• 1.1.4 CGMP調(diào)節(jié)的生理功能19-21
• 1.1.4.1 CGMP在視覺信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用19-20
• 1.1.4.2 NO/CGMP/PKG信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管平滑肌舒張20
• 1.1.4.3 CGMP對神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)20
• 1.1.4.4 CGMP信號(hào)調(diào)節(jié)的生理過程——腸分泌、腎素釋放與骨生長20-21
• 1.1.4.5 生殖作用21
• 1.1.4.6 癌癥21
• 1.1.4.7 NO-CGMP與細(xì)胞分化21
• 1.2. CGMP檢測方法的研究進(jìn)展21-22
• 1.3. 本課題的研究內(nèi)容22-23
• 第2章 CGMP免疫抗原的制備與鑒定23-30
• 2.1 材料與方法23-28
• 2.1.1 材料與設(shè)備23-24
• 2.1.1.1 主要儀器設(shè)備23-24
• 2.1.1.2 主要試劑及配制24
• 2.1.2 方法24-28
• 2.1.2.1 EDC方法制備CGMP-KLH24
• 2.1.2.2 SMCC法制備CGMP-KLH24-25
• 2.1.2.3 SPDP法制備CGMP-KLH25-26
• 2.1.2.4 CGMP-KLH濃度的測定26-27
• 2.1.2.5 CGMP-KLH免疫抗原的鑒定27-28
• 2.2 結(jié)果28
• 2.3 本章小結(jié)28-30
• 第3章 抗CGMP單克隆抗體的制備及鑒定30-43
• 3.1 材料和方法30-36
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備30
• 3.1.2 設(shè)備30-31
• 3.1.3 方法31-36
• 3.1.3.1 免疫兔子31-32
• 3.1.3.1.1 抗血清效價(jià)測定31-32
• 3.1.3.2 抗CGMP兔單抗的制備及鑒定32-36
• 3.1.3.2.1 抗CGMP兔單抗雜交瘤細(xì)胞的制備32-33
• 3.1.3.2.2 抗CGMP兔單抗大轉(zhuǎn)生產(chǎn)以及純化33-34
• 3.1.3.2.3 CGMP兔單抗的IGG含量測定34
• 3.1.3.2.4 CGMP兔單抗效價(jià)測定34-35
• 3.1.3.2.5 CGMP兔單抗與載體蛋白的交叉測定35-36
• 3.2 結(jié)果36-41
• 3.2.1 抗血清效價(jià)測定結(jié)果36
• 3.2.2 間接ELISA在融合階段的篩選結(jié)果36-37
• 3.2.3 間接競爭ELISA測定克隆對CGMP的競爭抑制率37-38
• 3.2.4 間接競爭ELISA測定克隆的特異性38
• 3.2.5 CGMP兔單抗的IGG含量測定結(jié)果38-39
• 3.2.6 CGMP兔單抗抗體效價(jià)39-40
• 3.2.7 針對載體蛋白的交叉反應(yīng)40
• 3.2.8 CGMP兔單抗抗體特異性檢測40-41
• 3.3 本章小結(jié)41-43
• 第4章 CGMP競爭ELISA方法的建立及初步應(yīng)用43-50
• 4.1 材料和方法43-45
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備43-44
• 4.1.1.1 主要試劑43
• 4.1.1.2 設(shè)備43-44
• 4.1.2 方法44-45
• 4.1.2.1 競爭ELISA條件的優(yōu)化44
• 4.1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以及靈敏度的確定44-45
• 4.1.2.3 檢測回收率45
• 4.1.2.4 驗(yàn)證精密度45
• 4.1.2.5 CGMP兔單抗競爭ELISA檢測方法用于樣本分析45
• 4.2 結(jié)果45-49
• 4.2.1 競爭ELISA優(yōu)化結(jié)果45-46
• 4.2.2 檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線46-47
• 4.2.3 回收率47-48
• 4.2.4 方法的精密度48
• 4.2.5 CGMP兔單抗競爭ELISA檢測方法用于樣本分析48-49
• 4.3 本章小結(jié)49-50
• 第5章 結(jié)論和討論50-54
• 5.1 抗原制備50-51
• 5.2 兔單抗的優(yōu)點(diǎn)51
• 5.3 兔單抗的特異性和效價(jià)51-52
• 5.4 該方法的驗(yàn)證52-54
• 參考文獻(xiàn)54-61
• 個(gè)人簡歷61

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 易鴻匹;;血漿環(huán)鳥苷酸對膽鹼能藥物的反應(yīng)[J];國外醫(yī)學(xué)參考資料(醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊);1978年02期

2 金英,張寶云,姚素艷,齊志敏,劉婉珠,趙艷杰;應(yīng)用腦微透析技術(shù)觀察大鼠紋狀體基礎(chǔ)環(huán)鳥苷酸來源及一氧化氮在紋狀體細(xì)胞內(nèi)對環(huán)鳥苷酸的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程錭[J];中國臨床康復(fù);2005年32期

3 于力;;尿中環(huán)鳥苷酸可能是一個(gè)癌的生化指標(biāo)[J];國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊;1981年01期

4 盧起;崔耀宗;;鼠肝中環(huán)鳥苷酸磷酸二酯酶比活力的測定[J];皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1991年02期

5 岳玉;王兵;江明君;謝冉;; 肝硬變時(shí)心鈉素與環(huán)鳥苷酸聯(lián)合檢測的臨床意義[J];蚌埠醫(yī)藥;1991年04期

6 胡禮文;環(huán)鳥苷酸對麻疹病毒復(fù)制的刺激作用[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1992年01期

7 戴德;;環(huán)鳥苷酸依賴性蛋白激酶拮抗酒精性中樞神經(jīng)細(xì)胞毒性機(jī)制研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2006年24期

8 王曉華,童梅,竇豆,Usha J Raj,高遠(yuǎn)生;環(huán)鳥苷酸依賴的蛋白激酶對心血管功能的調(diào)節(jié)作用[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2005年04期

9 王正朝;潘曉燕;龐訓(xùn)勝;;哺乳動(dòng)物可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的表達(dá)及其調(diào)控[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2006年05期

10 戴德;一氧化氮—環(huán)鳥苷酸通路與神經(jīng)生長因子拮抗酒精神經(jīng)毒性作用的關(guān)系[J];貴州醫(yī)藥;2002年08期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 朱云娜;王中華;汪良駒;;金雀異黃素和環(huán)鳥苷酸調(diào)控葡萄果實(shí)花青素積累[A];第二屆全國果樹分子生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 譚興梅;環(huán)鳥苷酸（cGMP）兔單抗的制備及競爭ELISA測定方法的建立[D];浙江大學(xué);2016年

，

本文編號(hào)：633330