本文關(guān)鍵詞：抗CD47納米抗體的制備和鑒定

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【摘要】：CD47是一種廣泛表達的膜蛋白,也稱為整合素相關(guān)蛋白(IAP)。作為巨噬細胞和髓樣細胞表面的信號調(diào)節(jié)蛋白α(Signal regulatory protein alpha,SIRPα)的配體,其與SIRPα的相互作用,對吞噬細胞提供了負調(diào)控信號,抑制了巨噬細胞的吞噬作用。近年來,發(fā)現(xiàn)CD47在白血病、淋巴瘤和幾乎所有實體瘤中均高表達,CD47-SIRPα信號的激活抑制了吞噬細胞對腫瘤的清除作用,成為腫瘤逃逸免疫監(jiān)視的機制之一。采用抗體或拮抗劑阻斷CD47-SIRPα信號通路,從而恢復(fù)免疫細胞功能,成為抗腫瘤免疫治療的新策略。食管癌是新疆地區(qū)高發(fā)癌癥之一,其對常規(guī)化療具有耐藥性并且預(yù)后不良,需要發(fā)展新的治療策略。目前,還沒有研究報道食管癌細胞是否表達CD47,也沒有靶向CD47治療食管癌的報道。納米抗體是駱駝中天然缺失輕鏈的重鏈抗體的可變區(qū)片段,是目前最小的具有完全抗原結(jié)合功能的單域抗體。因其具有分子小、組織穿透能力強、易于結(jié)合蛋白裂隙表位和生產(chǎn)成本低等優(yōu)點,已經(jīng)成為開發(fā)新一代治療抗體很有希望的候選分子。本研究的目的主要有兩方面,一是通過CD47單抗對食管癌的作用,初步評價CD47作為抗食管癌細胞作用靶點的價值;另一方面是建立雙峰駝天然VHH噬菌體文庫,通過噬菌體展示技術(shù),篩選和獲得抗CD47納米抗體,為今后開展納米抗體抗腫瘤作用研究提供基礎(chǔ)。本研究主要包括以下兩部分內(nèi)容:1.抗CD47單克隆抗體對體外食管癌細胞的抗腫瘤作用研究首先采用RT-PCR、流式細胞術(shù)、Western-Blot和細胞免疫熒光等檢測食管癌細胞表面CD47的表達。其次,采用小鼠巨噬細胞體外吞噬實驗檢測抗CD47單克隆抗體(B6H12)對食管癌的抗腫瘤作用。采用CFSE對食管癌細胞進行熒光標記。食管癌細胞增殖和凋亡分別采用CCK-8和Annexin V-FITC用流式細胞儀檢測。結(jié)果表明,所有檢測的食管癌細胞與Vero細胞相比CD47表達差異顯著;其中ec9706和kyse150細胞cd47的表達顯著高于eca-109細胞。對ec9706和kyse150進行的細胞增殖和吞噬實驗結(jié)果顯示,抗cd47單抗(b6h12)處理后的細胞系,細胞增殖受到明顯的影響,與igg1同種型抗體相比,差異顯著(p0.05)。將小鼠巨噬細胞與cfse標記的ec9706和kyse150細胞共孵育,抗cd47單抗(b6h12)與igg1同種型抗體相比,小鼠巨噬細胞對食管癌細胞ec9706和kyse150的吞噬作用明顯增強,差異極顯著(p0.01),且吞噬指數(shù)達0.2。這些結(jié)果表明食管癌細胞系(ec9706和kyse150)高表達cd47,抗cd47單抗能夠促進巨噬細胞對所研究的食管癌細胞的吞噬作用,為靶向cd47治療食管癌提供依據(jù)。2.噬菌體展示技術(shù)篩選和鑒定抗cd47納米抗體首先采用dna重組技術(shù)制備cd47蛋白。以人cd47基因全長cdna克隆為模板,pcr擴增cd47胞外區(qū)基因片段,構(gòu)建pet30a-cd47重組質(zhì)粒,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達經(jīng)鎳離子純化,利用抗cd47單抗進行鑒定。將純化蛋白對新疆雙峰駝進行免疫,獲得駱駝抗cd47蛋白的多克隆抗體,用于分析抗體對cd47蛋白的結(jié)合情況。其次,采用噬菌體展示技術(shù)制備納米抗體。從采自5頭駱駝的外周淋巴細胞中提取rna反轉(zhuǎn)錄cdna為模板擴增vhh基因片段,經(jīng)過psti/noti雙酶切后連接到pmecs載體上,電轉(zhuǎn)化tg1大腸桿菌細胞形成vhh天然抗體文庫。vhh噬菌體展示文庫采用m13ko7輔助噬菌體超感染、擴增以及peg8000沉淀純化獲得。采用親和淘洗方法,在elisa板上用純化的重組cd47蛋白對噬菌體展示文庫進行三輪篩選,對篩選輸出的噬菌體采用多克隆噬菌體elisa測定富集指數(shù)。對輔助噬菌體感染后生長在瓊脂平板上的陽性克隆,采用菌落pcr和序列測定進行鑒定。陽性納米抗體基因序列亞克隆到原核表達載體進行誘導(dǎo)、表達和純化。采用抗c-myc酶標二抗在elisa中檢測納米抗體與重組cd47抗原的結(jié)合活性和親和力。cd47基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化后,經(jīng)0.2mmiptg誘導(dǎo),在大腸桿菌bl21(de3)菌株中獲得高表達。經(jīng)ni-離子親和層析純化后得到純度約90%的cd47重組蛋白,并可被抗cd47單抗(b6h12)特異結(jié)合。elisa測定cd47蛋白免疫的新疆雙峰駝抗血清效價可達1:200000,說明CD47蛋白在駱駝體內(nèi)能激發(fā)免疫反應(yīng),為今后構(gòu)建免疫文庫提供基礎(chǔ)。從駱駝外周血淋巴細胞中,采用VHH特異引物構(gòu)建了庫容為1.4×109cfu天然VHH納米抗體噬菌體展示文庫,從文庫中隨機選取91個菌落,測序分析其中有85個VHH抗體,表明文庫質(zhì)量較高。經(jīng)過三輪親和篩選,獲得了輸出量為6.0×104cfu的噬菌體,多克隆噬菌體ELISA結(jié)果表明富集指數(shù)達10。從第三輪篩選輸出噬菌體感染的菌落生長的瓊脂平板中隨機挑取38個單克隆,進行菌落PCR鑒定和序列測定表明38個均為陽性克隆。挑選其中3個噬菌體克隆,VHH-CD47-201、VHH-CD47-204和VHH-CD47-802,亞克隆到pET30a在BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)。表達的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE檢測分別在25 kDa、28 kDa和21 kDa出現(xiàn)目的條帶,與預(yù)期大小一致。純化后得到純度約90%的納米抗體。間接ELISA結(jié)果表明,VHH-CD47-201重組納米抗體能與CD47蛋白結(jié)合。本研究首次表明,CD47蛋白在本次研究的食管癌細胞系表面高表達,抗CD47單抗能夠促進巨噬細胞對食管癌細胞的吞噬作用。從天然VHH噬菌體文庫中可以獲得具有一定結(jié)合力的抗CD47納米抗體。該研究為進一步開展納米抗體抗腫瘤作用打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：食管癌細胞 CD47 納米抗體 抗體靶向治療 噬菌體展示
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392;TB383.1
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-10
• 英文縮略語10-14
• 第一部分 CD47及其配體SIRPα 與腫瘤的相關(guān)性14-27
• 1 CD47的生物學(xué)作用14-16
• 1.1 CD47的基本特征14-15
• 1.2 CD47的主要配體和生物學(xué)功能15
• 1.3 CD47與T細胞之間的相互作用15-16
• 2 SIRPα 的生物學(xué)作用16
• 3 CD47和SIRPα 的表達16-17
• 4 CD47-SIRPα 相互作用及信號通路17-19
• 4.1 CD47-SIRPα 相互作用17-18
• 4.2 CD47-SIRPα 信號通路18
• 4.3 CD47- SIRPα 信號通路在腫瘤免疫逃逸中的作用18-19
• 5 靶向CD47抗腫瘤免疫治療的研究進展19-21
• 5.1 靶向CD47的抗體作用的主要機制19-20
• 5.2 靶向CD47的抗體作用于腫瘤的選擇性20
• 5.3 靶向CD47抗體腫瘤治療的聯(lián)合策略20-21
• 6 展望21
• 參考文獻21-27
• 第二部分 實驗研究27-86
• 第一章 抗CD47單克隆抗體可通過促進體外巨噬細胞對食管癌細胞的吞噬發(fā)揮抗腫瘤作用27-42
• 1 實驗材料28-29
• 1.1 主要儀器28
• 1.2 細胞及質(zhì)粒28
• 1.3 引物與試劑28
• 1.4 培養(yǎng)基及溶液配制28-29
• 1.5 數(shù)據(jù)分析29
• 2 方法29-33
• 2.1 食管癌細胞的培養(yǎng)與保存29
• 2.2 食管癌細胞中RNA的提取及c DNA的合成29-30
• 2.3 RT-PCR檢測食管癌細胞系中的CD4730
• 2.4 流式細胞術(shù)檢測食管癌細胞CD47因子30-31
• 2.5 食管癌細胞膜蛋白的提取31
• 2.6 Western-Blotting檢測食管癌細胞系中CD47的表達31-32
• 2.7 免疫熒光檢測食管癌細胞表達CD47蛋白32
• 2.8 檢測抗CD47抗體對食管癌細胞的增殖影響32
• 2.9 抗CD47單抗促吞噬實驗32-33
• 3 結(jié)果與分析33-39
• 3.1 食管癌細胞中RNA的提取33-34
• 3.2 RT-PCR檢測食管癌細胞系中的CD4734-35
• 3.3 CD47因子在食管癌細胞的表達35
• 3.4 Western-Blotting檢測食管癌細胞膜蛋白中CD47的表達35-36
• 3.5 免疫熒光檢測食管癌細胞中CD4736-37
• 3.6 抗CD47單克隆抗體對食管癌細胞增殖的影響37-38
• 3.7 抗CD47單克隆抗體促吞噬實驗38-39
• 4 討論39-40
• 參考文獻40-42
• 第二章 在大腸桿菌中表達、純化和鑒定CD47胞外區(qū)重組蛋白42-57
• 1 實驗材料42-44
• 1.1 菌種及質(zhì)粒42
• 1.2 引物與試劑42-43
• 1.3 培養(yǎng)基及溶液配制43-44
• 2 實驗方法44-50
• 2.1 p ET-30a-CD47重組質(zhì)粒的構(gòu)建44-46
• 2.1.1 引物的設(shè)計44
• 2.1.2 PCR擴增CD47基因44-45
• 2.1.3 p ET-30a質(zhì)粒的制備45-46
• 2.1.4 p ET-30a質(zhì)粒與CD47基因片段的連接46
• 2.1.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化46
• 2.2 轉(zhuǎn)化子的鑒定46-47
• 2.2.1 DH5α-p ET-30a-CD47轉(zhuǎn)化子的鑒定46-47
• 2.2.2 p ET-30a-CD47重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定47
• 2.3 CD47蛋白的誘導(dǎo)表達及純化47-48
• 2.3.1 BL21-p ET-30a-CD47誘導(dǎo)條件摸索47
• 2.3.2 BL21-p ET-30a-CD47大量誘導(dǎo)表達47-48
• 2.3.3 CD47蛋白的純化48
• 2.4 CD47密碼子優(yōu)化48-49
• 2.5 Western Blot檢測CD47蛋白49
• 2.6 CD47蛋白免疫新疆雙峰駝49
• 2.7 免疫血清效價測定49-50
• 3 實驗結(jié)果50-55
• 3.1 p ET-30a-CD47原核表達載體的構(gòu)建50
• 3.2 p ET-30a-CD47的鑒定50-51
• 3.3 CD47蛋白的誘導(dǎo)表達及純化51-52
• 3.4 CD47基因中稀有密碼子優(yōu)化結(jié)果52-53
• 3.5 密碼子優(yōu)化后的CD47蛋白的構(gòu)建及表達純化53-54
• 3.6 Western Blot檢測CD47蛋白54
• 3.7 血清效價的測定54-55
• 4 討論55-56
• 參考文獻56-57
• 第三章 雙峰駝天然VHH噬菌體展示文庫的構(gòu)建及抗CD47納米抗體的篩選57-86
• 1 實驗材料59-61
• 1.1 菌種及質(zhì)粒59
• 1.2 試劑59
• 1.3 引物設(shè)計59-60
• 1.4 培養(yǎng)基及溶液配制60-61
• 2 實驗方法61-67
• 2.1 VHH天然噬菌體展示文庫的構(gòu)建61-64
• 2.1.1 新疆雙峰駝血液的采集和淋巴細胞的分離61
• 2.1.2 淋巴細胞總RNA的提取和c DNA的合成61-62
• 2.1.3 以c DNA為模板擴增VHH基因62-63
• 2.1.4 p MECS載體及VHH基因片段的酶切回收和連接63
• 2.1.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和VHH抗體庫的構(gòu)建63-64
• 2.1.6 VHH抗體文庫的質(zhì)量評估64
• 2.2 VHH噬菌體展示文庫的篩選64-66
• 2.2.1 TG1大腸桿菌的擴增64
• 2.2.2 M13KO7輔助噬菌體的培養(yǎng)和濃縮64-65
• 2.2.3 M13KO7輔助噬菌體滴度的測定65
• 2.2.4 VHH抗體文庫的表達和分離65
• 2.2.5 VHH展示文庫滴度測定65-66
• 2.3 VHH噬菌體展示文庫的親和淘洗66
• 2.4 多克隆噬菌體ELISA檢測VHH噬菌體克隆的富集66-67
• 2.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建67
• 2.6 ELISA檢測VHH-CD47納米抗體的抗原結(jié)合活性67
• 3 結(jié)果與分析67-83
• 3.1 VHH抗體庫的構(gòu)建及鑒定67-76
• 3.1.1 淋巴細胞總RNA的提取67-68
• 3.1.2 VHH基因片段的擴增68-69
• 3.1.3 VHH抗體庫的構(gòu)建及鑒定69-70
• 3.1.4 雙峰駝抗體序列的分析70-76
• 3.2 VHH噬菌體展示文庫的表達76-77
• 3.2.1 噬菌體滴度的測定76
• 3.2.2 VHH展示文庫的滴度測定76-77
• 3.3 VHH展示文庫的篩選及鑒定77-79
• 3.4 VHH展示文庫的鑒定79-80
• 3.5 VHH-CD47納米抗體的構(gòu)建及鑒定80-83
• 3.5.1 p ET-30a-VHH-CD47原核表達載體的構(gòu)建80-81
• 3.5.2 VHH-CD47納米抗體的原核表達及純化81-82
• 3.5.3 VHH-CD47納米抗體的鑒定82-83
• 4 討論83
• 參考文獻83-86
• 第三部分 結(jié)論與展望86-88
• 結(jié)論86-87
• 展望87-88
• 致謝88-89
• 個人簡歷89
• 參與課題及發(fā)表文章89-90

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 徐蓮;高樹峰;張少容;;CD47在腫瘤防治中的作用[J];廣東醫(yī)學(xué);2014年18期

2 李倩;彭琪;夏平方;魏姍姍;佘妙容;;白血病干細胞免疫表型在治療急性髓系白血病方面的研究進展[J];中國輸血雜志;2015年04期

3 蘭泓;孔劭凡;李慎濤;張玉祥;;稀有密碼子影響人RNaseH-Apaf1融合蛋白原核表達[J];氨基酸和生物資源;2015年04期

4 周敏;萬慧穎;劉楊英;陳金;;白芍總苷聯(lián)合復(fù)方甘草酸苷治療斑禿療效評價及對血清TNF-α、TGF-β1和IL-12的影響[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2014年06期

5 周敏;萬慧穎;陳金;陳琦;;沙利度胺對結(jié)節(jié)性癢疹患者血清TNF-α、IL-12的影響[J];皮膚性病診療學(xué)雜志;2014年06期

6 徐進;劉濤;趙自葉;彭曉蕓;夏懋;郭懷祖;張大鵬;錢衛(wèi)珠;王皓;;重組信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)胞外段及其高親和力突變體的表達、純化與活性鑒定[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2014年05期

7 楊梅;吳敬波;張智慧;;CD47與淋巴瘤相關(guān)性的研究進展[J];腫瘤預(yù)防與治療;2014年06期

8 陸倩;李慶山;潘婷;吳雪峰;蔣健;杜慶華;許世林;;初治急性白血病患者CD133的表達與臨床特征關(guān)系的探討[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2015年03期

9 鄭晨宏;謝曉華;;靶向CD_(47)及其配體TSP-1/SIRPα在免疫及損傷應(yīng)答中的研究進展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2015年22期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 程曉蕾;陳宏;;Th17細胞與變態(tài)反應(yīng)性疾病的研究現(xiàn)狀[A];第六次全國中西醫(yī)結(jié)合變態(tài)反應(yīng)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2013年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊帆;疏肝健脾固髓方治療多發(fā)性硬化的臨床及機制的初步研究[D];中國中醫(yī)科學(xué)院;2013年

2 高昆;轉(zhuǎn)基因過表達白細胞介素33（IL-33）對小鼠腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移作用的研究及機制探討[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

3 徐yN欣;E2/MSC調(diào)控B細胞的功能及IL-12基因抑制鱗癌的作用[D];南京大學(xué);2013年

4 沈培;小鼠GITR的表達及其對實驗性自身免疫性甲狀腺炎干預(yù)的研究[D];江蘇大學(xué);2014年

5 賴宗浪;以LSC為靶標的復(fù)方浙貝顆粒抗AML臨床研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2014年

6 劉建明;microRNA在胃癌細胞株MKN-45腫瘤干細胞中的表達譜研究[D];蘇州大學(xué);2014年

7 邱少偉;1、iASPP與Sertad1的相互作用對白血病細胞增殖和凋亡的調(diào)控 2、N-cadherin和Tie2作為白血病干細胞標記的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

8 陶景蓮;骨髓增生異常綜合征患者骨髓TIM3+造血干細胞的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2014年

9 黃純美;中藥喘可治注射液對COPD大鼠IL-12/STAT4、IL-4/STAT6信號通路影響研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2014年

10 伍平;IL12-IFNγ通路因子基因多態(tài)性及表達水平與脊柱結(jié)核的相關(guān)性研究[D];中南大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 許秋生;康復(fù)預(yù)處理對EAE小鼠脾淋巴細胞Th17和Treg及血清IL-17和TGF-β1的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2013年

2 李雯;DA與IA方案治療成人初治急性髓系白血病的療效比較分析[D];福建醫(yī)科大學(xué);2013年

3 鞠寶輝;卵巢癌CD47表達水平及靶向治療的體外研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

4 汪小姣;CLL-1在急性髓系白血病中的表達及其臨床意義[D];鄭州大學(xué);2013年

5 劉曉曦;熱應(yīng)激大鼠腸道抗原遞呈及黏膜免疫功能的變化[D];北京農(nóng)學(xué)院;2013年

6 紀國文;卡介菌多糖核酸對哮喘大鼠肺組織IL-12/STAT4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[D];遼寧醫(yī)學(xué)院;2013年

7 王詩韻;Disulfiram聯(lián)合Cu通過上調(diào)ROS-JNK及下調(diào)Nrf2、NF-κB通路靶向殺傷AML干細胞[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

8 尚利明;黃芪多糖的發(fā)酵提取工藝優(yōu)化及其對小鼠樹突狀細胞體外成熟的影響[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

9 詹碧翠;急性白血病CD47的表達及其臨床意義研究[D];浙江大學(xué);2013年

10 高樹峰;慢病毒介導(dǎo)的siRNA靶向CD47基因?qū)θ撕戆┘毎鸋ep-2增殖、凋亡影響的實驗研究[D];南昌大學(xué);2014年

，

本文編號：589359