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抗CD47納米抗體的制備和鑒定

發(fā)布時間:2017-07-29 13:16

  本文關(guān)鍵詞:抗CD47納米抗體的制備和鑒定


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【摘要】:CD47是一種廣泛表達的膜蛋白,也稱為整合素相關(guān)蛋白(IAP)。作為巨噬細胞和髓樣細胞表面的信號調(diào)節(jié)蛋白α(Signal regulatory protein alpha,SIRPα)的配體,其與SIRPα的相互作用,對吞噬細胞提供了負調(diào)控信號,抑制了巨噬細胞的吞噬作用。近年來,發(fā)現(xiàn)CD47在白血病、淋巴瘤和幾乎所有實體瘤中均高表達,CD47-SIRPα信號的激活抑制了吞噬細胞對腫瘤的清除作用,成為腫瘤逃逸免疫監(jiān)視的機制之一。采用抗體或拮抗劑阻斷CD47-SIRPα信號通路,從而恢復(fù)免疫細胞功能,成為抗腫瘤免疫治療的新策略。食管癌是新疆地區(qū)高發(fā)癌癥之一,其對常規(guī)化療具有耐藥性并且預(yù)后不良,需要發(fā)展新的治療策略。目前,還沒有研究報道食管癌細胞是否表達CD47,也沒有靶向CD47治療食管癌的報道。納米抗體是駱駝中天然缺失輕鏈的重鏈抗體的可變區(qū)片段,是目前最小的具有完全抗原結(jié)合功能的單域抗體。因其具有分子小、組織穿透能力強、易于結(jié)合蛋白裂隙表位和生產(chǎn)成本低等優(yōu)點,已經(jīng)成為開發(fā)新一代治療抗體很有希望的候選分子。本研究的目的主要有兩方面,一是通過CD47單抗對食管癌的作用,初步評價CD47作為抗食管癌細胞作用靶點的價值;另一方面是建立雙峰駝天然VHH噬菌體文庫,通過噬菌體展示技術(shù),篩選和獲得抗CD47納米抗體,為今后開展納米抗體抗腫瘤作用研究提供基礎(chǔ)。本研究主要包括以下兩部分內(nèi)容:1.抗CD47單克隆抗體對體外食管癌細胞的抗腫瘤作用研究首先采用RT-PCR、流式細胞術(shù)、Western-Blot和細胞免疫熒光等檢測食管癌細胞表面CD47的表達。其次,采用小鼠巨噬細胞體外吞噬實驗檢測抗CD47單克隆抗體(B6H12)對食管癌的抗腫瘤作用。采用CFSE對食管癌細胞進行熒光標記。食管癌細胞增殖和凋亡分別采用CCK-8和Annexin V-FITC用流式細胞儀檢測。結(jié)果表明,所有檢測的食管癌細胞與Vero細胞相比CD47表達差異顯著;其中ec9706和kyse150細胞cd47的表達顯著高于eca-109細胞。對ec9706和kyse150進行的細胞增殖和吞噬實驗結(jié)果顯示,抗cd47單抗(b6h12)處理后的細胞系,細胞增殖受到明顯的影響,與igg1同種型抗體相比,差異顯著(p0.05)。將小鼠巨噬細胞與cfse標記的ec9706和kyse150細胞共孵育,抗cd47單抗(b6h12)與igg1同種型抗體相比,小鼠巨噬細胞對食管癌細胞ec9706和kyse150的吞噬作用明顯增強,差異極顯著(p0.01),且吞噬指數(shù)達0.2。這些結(jié)果表明食管癌細胞系(ec9706和kyse150)高表達cd47,抗cd47單抗能夠促進巨噬細胞對所研究的食管癌細胞的吞噬作用,為靶向cd47治療食管癌提供依據(jù)。2.噬菌體展示技術(shù)篩選和鑒定抗cd47納米抗體首先采用dna重組技術(shù)制備cd47蛋白。以人cd47基因全長cdna克隆為模板,pcr擴增cd47胞外區(qū)基因片段,構(gòu)建pet30a-cd47重組質(zhì)粒,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達經(jīng)鎳離子純化,利用抗cd47單抗進行鑒定。將純化蛋白對新疆雙峰駝進行免疫,獲得駱駝抗cd47蛋白的多克隆抗體,用于分析抗體對cd47蛋白的結(jié)合情況。其次,采用噬菌體展示技術(shù)制備納米抗體。從采自5頭駱駝的外周淋巴細胞中提取rna反轉(zhuǎn)錄cdna為模板擴增vhh基因片段,經(jīng)過psti/noti雙酶切后連接到pmecs載體上,電轉(zhuǎn)化tg1大腸桿菌細胞形成vhh天然抗體文庫。vhh噬菌體展示文庫采用m13ko7輔助噬菌體超感染、擴增以及peg8000沉淀純化獲得。采用親和淘洗方法,在elisa板上用純化的重組cd47蛋白對噬菌體展示文庫進行三輪篩選,對篩選輸出的噬菌體采用多克隆噬菌體elisa測定富集指數(shù)。對輔助噬菌體感染后生長在瓊脂平板上的陽性克隆,采用菌落pcr和序列測定進行鑒定。陽性納米抗體基因序列亞克隆到原核表達載體進行誘導(dǎo)、表達和純化。采用抗c-myc酶標二抗在elisa中檢測納米抗體與重組cd47抗原的結(jié)合活性和親和力。cd47基因經(jīng)過密碼子優(yōu)化后,經(jīng)0.2mmiptg誘導(dǎo),在大腸桿菌bl21(de3)菌株中獲得高表達。經(jīng)ni-離子親和層析純化后得到純度約90%的cd47重組蛋白,并可被抗cd47單抗(b6h12)特異結(jié)合。elisa測定cd47蛋白免疫的新疆雙峰駝抗血清效價可達1:200000,說明CD47蛋白在駱駝體內(nèi)能激發(fā)免疫反應(yīng),為今后構(gòu)建免疫文庫提供基礎(chǔ)。從駱駝外周血淋巴細胞中,采用VHH特異引物構(gòu)建了庫容為1.4×109cfu天然VHH納米抗體噬菌體展示文庫,從文庫中隨機選取91個菌落,測序分析其中有85個VHH抗體,表明文庫質(zhì)量較高。經(jīng)過三輪親和篩選,獲得了輸出量為6.0×104cfu的噬菌體,多克隆噬菌體ELISA結(jié)果表明富集指數(shù)達10。從第三輪篩選輸出噬菌體感染的菌落生長的瓊脂平板中隨機挑取38個單克隆,進行菌落PCR鑒定和序列測定表明38個均為陽性克隆。挑選其中3個噬菌體克隆,VHH-CD47-201、VHH-CD47-204和VHH-CD47-802,亞克隆到pET30a在BL21(DE3)中進行誘導(dǎo)。表達的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE檢測分別在25 kDa、28 kDa和21 kDa出現(xiàn)目的條帶,與預(yù)期大小一致。純化后得到純度約90%的納米抗體。間接ELISA結(jié)果表明,VHH-CD47-201重組納米抗體能與CD47蛋白結(jié)合。本研究首次表明,CD47蛋白在本次研究的食管癌細胞系表面高表達,抗CD47單抗能夠促進巨噬細胞對食管癌細胞的吞噬作用。從天然VHH噬菌體文庫中可以獲得具有一定結(jié)合力的抗CD47納米抗體。該研究為進一步開展納米抗體抗腫瘤作用打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】:食管癌細胞 CD47 納米抗體 抗體靶向治療 噬菌體展示
【學(xué)位授予單位】:新疆大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號】:R392;TB383.1
【目錄】:
  • 摘要3-6
  • Abstract6-10
  • 英文縮略語10-14
  • 第一部分 CD47及其配體SIRPα 與腫瘤的相關(guān)性14-27
  • 1 CD47的生物學(xué)作用14-16
  • 1.1 CD47的基本特征14-15
  • 1.2 CD47的主要配體和生物學(xué)功能15
  • 1.3 CD47與T細胞之間的相互作用15-16
  • 2 SIRPα 的生物學(xué)作用16
  • 3 CD47和SIRPα 的表達16-17
  • 4 CD47-SIRPα 相互作用及信號通路17-19
  • 4.1 CD47-SIRPα 相互作用17-18
  • 4.2 CD47-SIRPα 信號通路18
  • 4.3 CD47- SIRPα 信號通路在腫瘤免疫逃逸中的作用18-19
  • 5 靶向CD47抗腫瘤免疫治療的研究進展19-21
  • 5.1 靶向CD47的抗體作用的主要機制19-20
  • 5.2 靶向CD47的抗體作用于腫瘤的選擇性20
  • 5.3 靶向CD47抗體腫瘤治療的聯(lián)合策略20-21
  • 6 展望21
  • 參考文獻21-27
  • 第二部分 實驗研究27-86
  • 第一章 抗CD47單克隆抗體可通過促進體外巨噬細胞對食管癌細胞的吞噬發(fā)揮抗腫瘤作用27-42
  • 1 實驗材料28-29
  • 1.1 主要儀器28
  • 1.2 細胞及質(zhì)粒28
  • 1.3 引物與試劑28
  • 1.4 培養(yǎng)基及溶液配制28-29
  • 1.5 數(shù)據(jù)分析29
  • 2 方法29-33
  • 2.1 食管癌細胞的培養(yǎng)與保存29
  • 2.2 食管癌細胞中RNA的提取及c DNA的合成29-30
  • 2.3 RT-PCR檢測食管癌細胞系中的CD4730
  • 2.4 流式細胞術(shù)檢測食管癌細胞CD47因子30-31
  • 2.5 食管癌細胞膜蛋白的提取31
  • 2.6 Western-Blotting檢測食管癌細胞系中CD47的表達31-32
  • 2.7 免疫熒光檢測食管癌細胞表達CD47蛋白32
  • 2.8 檢測抗CD47抗體對食管癌細胞的增殖影響32
  • 2.9 抗CD47單抗促吞噬實驗32-33
  • 3 結(jié)果與分析33-39
  • 3.1 食管癌細胞中RNA的提取33-34
  • 3.2 RT-PCR檢測食管癌細胞系中的CD4734-35
  • 3.3 CD47因子在食管癌細胞的表達35
  • 3.4 Western-Blotting檢測食管癌細胞膜蛋白中CD47的表達35-36
  • 3.5 免疫熒光檢測食管癌細胞中CD4736-37
  • 3.6 抗CD47單克隆抗體對食管癌細胞增殖的影響37-38
  • 3.7 抗CD47單克隆抗體促吞噬實驗38-39
  • 4 討論39-40
  • 參考文獻40-42
  • 第二章 在大腸桿菌中表達、純化和鑒定CD47胞外區(qū)重組蛋白42-57
  • 1 實驗材料42-44
  • 1.1 菌種及質(zhì)粒42
  • 1.2 引物與試劑42-43
  • 1.3 培養(yǎng)基及溶液配制43-44
  • 2 實驗方法44-50
  • 2.1 p ET-30a-CD47重組質(zhì)粒的構(gòu)建44-46
  • 2.1.1 引物的設(shè)計44
  • 2.1.2 PCR擴增CD47基因44-45
  • 2.1.3 p ET-30a質(zhì)粒的制備45-46
  • 2.1.4 p ET-30a質(zhì)粒與CD47基因片段的連接46
  • 2.1.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化46
  • 2.2 轉(zhuǎn)化子的鑒定46-47
  • 2.2.1 DH5α-p ET-30a-CD47轉(zhuǎn)化子的鑒定46-47
  • 2.2.2 p ET-30a-CD47重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定47
  • 2.3 CD47蛋白的誘導(dǎo)表達及純化47-48
  • 2.3.1 BL21-p ET-30a-CD47誘導(dǎo)條件摸索47
  • 2.3.2 BL21-p ET-30a-CD47大量誘導(dǎo)表達47-48
  • 2.3.3 CD47蛋白的純化48
  • 2.4 CD47密碼子優(yōu)化48-49
  • 2.5 Western Blot檢測CD47蛋白49
  • 2.6 CD47蛋白免疫新疆雙峰駝49
  • 2.7 免疫血清效價測定49-50
  • 3 實驗結(jié)果50-55
  • 3.1 p ET-30a-CD47原核表達載體的構(gòu)建50
  • 3.2 p ET-30a-CD47的鑒定50-51
  • 3.3 CD47蛋白的誘導(dǎo)表達及純化51-52
  • 3.4 CD47基因中稀有密碼子優(yōu)化結(jié)果52-53
  • 3.5 密碼子優(yōu)化后的CD47蛋白的構(gòu)建及表達純化53-54
  • 3.6 Western Blot檢測CD47蛋白54
  • 3.7 血清效價的測定54-55
  • 4 討論55-56
  • 參考文獻56-57
  • 第三章 雙峰駝天然VHH噬菌體展示文庫的構(gòu)建及抗CD47納米抗體的篩選57-86
  • 1 實驗材料59-61
  • 1.1 菌種及質(zhì)粒59
  • 1.2 試劑59
  • 1.3 引物設(shè)計59-60
  • 1.4 培養(yǎng)基及溶液配制60-61
  • 2 實驗方法61-67
  • 2.1 VHH天然噬菌體展示文庫的構(gòu)建61-64
  • 2.1.1 新疆雙峰駝血液的采集和淋巴細胞的分離61
  • 2.1.2 淋巴細胞總RNA的提取和c DNA的合成61-62
  • 2.1.3 以c DNA為模板擴增VHH基因62-63
  • 2.1.4 p MECS載體及VHH基因片段的酶切回收和連接63
  • 2.1.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和VHH抗體庫的構(gòu)建63-64
  • 2.1.6 VHH抗體文庫的質(zhì)量評估64
  • 2.2 VHH噬菌體展示文庫的篩選64-66
  • 2.2.1 TG1大腸桿菌的擴增64
  • 2.2.2 M13KO7輔助噬菌體的培養(yǎng)和濃縮64-65
  • 2.2.3 M13KO7輔助噬菌體滴度的測定65
  • 2.2.4 VHH抗體文庫的表達和分離65
  • 2.2.5 VHH展示文庫滴度測定65-66
  • 2.3 VHH噬菌體展示文庫的親和淘洗66
  • 2.4 多克隆噬菌體ELISA檢測VHH噬菌體克隆的富集66-67
  • 2.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建67
  • 2.6 ELISA檢測VHH-CD47納米抗體的抗原結(jié)合活性67
  • 3 結(jié)果與分析67-83
  • 3.1 VHH抗體庫的構(gòu)建及鑒定67-76
  • 3.1.1 淋巴細胞總RNA的提取67-68
  • 3.1.2 VHH基因片段的擴增68-69
  • 3.1.3 VHH抗體庫的構(gòu)建及鑒定69-70
  • 3.1.4 雙峰駝抗體序列的分析70-76
  • 3.2 VHH噬菌體展示文庫的表達76-77
  • 3.2.1 噬菌體滴度的測定76
  • 3.2.2 VHH展示文庫的滴度測定76-77
  • 3.3 VHH展示文庫的篩選及鑒定77-79
  • 3.4 VHH展示文庫的鑒定79-80
  • 3.5 VHH-CD47納米抗體的構(gòu)建及鑒定80-83
  • 3.5.1 p ET-30a-VHH-CD47原核表達載體的構(gòu)建80-81
  • 3.5.2 VHH-CD47納米抗體的原核表達及純化81-82
  • 3.5.3 VHH-CD47納米抗體的鑒定82-83
  • 4 討論83
  • 參考文獻83-86
  • 第三部分 結(jié)論與展望86-88
  • 結(jié)論86-87
  • 展望87-88
  • 致謝88-89
  • 個人簡歷89
  • 參與課題及發(fā)表文章89-90

【共引文獻】

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