本文關(guān)鍵詞：血漿高分子量激肽原在宿主防御細菌感染中的作用及機制的初步研究

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【摘要】：【研究背景和意義】血漿高分子量激肽原(High molecular weight kininogen,HK)是血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(Plasma kallikrein-kinin system,KKS)的關(guān)鍵蛋白。已有體外研究表明,HK的第三個結(jié)構(gòu)域和第五個結(jié)構(gòu)域的片段均具有抗菌作用。但是,對于HK在體內(nèi)的作用仍然是未知的。本研究使用HK蛋白缺陷的Kng1-/-小鼠,研究HK在宿主防御細菌感染中的作用并初步探究其作用機制�！狙芯磕康摹空J識HK蛋白在宿主防御細菌感染中的作用并初步探究其作用機制�！狙芯糠椒ā拷⒋竽c桿菌(Escherichia coli,E.coli)腹腔注射模型和盲腸結(jié)扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)模型,觀察Kng1-/-小鼠和其同窩對照Kng1+/+小鼠的生存率,并繪制生存曲線。通過HE染色觀察和評價盲腸結(jié)扎穿孔模型中肺臟和肝臟的病理變化;應(yīng)用血平板計數(shù)檢測腹腔灌洗液、血液及脾臟和肝臟組織中細菌的數(shù)目;應(yīng)用實時定量PCR檢測白細胞中炎癥因子m RNA的表達水平;利用Western blotting方法檢測HK與細菌的結(jié)合及HK的裂解;利用Kng1+/+小鼠和Kng1-/-小鼠血漿檢測HK蛋白的殺菌效率;利用PK抑制劑DX-2930和FXII抑制劑CTI對血漿蛋白活性的干預(yù),檢測大腸桿菌導(dǎo)致HK的裂解及HK的殺菌效率是否依賴于KKS的活化�！狙芯拷Y(jié)果】(1)Kng1基因敲除小鼠肝臟中沒有Kng1 m RNA的表達,并且血漿中檢測不到HK蛋白,證實Kng1基因敲除小鼠模型建立成功。(2)在細菌感染模型中,與Kng1+/+小鼠相比,Kng1-/-小鼠的生存率明顯降低(大腸桿菌腹腔注射模型中小鼠的生存率:67.5%vs.11.111%,p=0.0017;盲腸結(jié)扎穿孔模型中小鼠的生存率:75%vs.11.667%,p=0.0434;Kng1+/+vs.Kng1-/-),提示血漿HK在宿主防御細菌感染中具有保護作用;(3)HE染色結(jié)果顯示,盲腸結(jié)扎穿孔模型中,Kng1+/+小鼠肺組織中有少量炎性細胞浸潤,肺間質(zhì)增生較弱,肝臟有輕微氣球樣變性,提示細菌感染可以導(dǎo)致肺臟及肝臟病理損傷。而Kng1-/-小鼠上述肺臟和肝臟病理表現(xiàn)明顯加重,肺組織中可見大量炎性細胞浸潤,肺間質(zhì)增生明顯,肝臟發(fā)生明顯氣球樣變性。上述觀察提示在細菌感染中,HK的缺陷可以加劇肺和肝臟組織損傷;(4)在大腸桿菌(108 colony-forming unit(CFU),200?l)腹腔注射后18小時,Kng1+/+小鼠腹腔灌洗液、血液、肝臟和脾臟中可以檢測到少量細菌的存在,提示細菌感染模型成功構(gòu)建。Kng1-/-小鼠上述組分中細菌的數(shù)目明顯增多(腹腔灌洗液:235000±59690 vs.944400±156400 CFU,p=0.0002;血液:0.5000±0.1581 vs.3.938±1.142 CFU,p=0.0056;肝臟:90630±32260 vs.845600±156200 CFU,p0.0001;脾臟:338100±71100 vs.1033000±154700 CFU,p=0.0003;Kng1+/+vs.Kng1-/-),提示在細菌感染中,HK的缺陷抑制體內(nèi)細菌的清除。(5)應(yīng)用實時定量PCR發(fā)現(xiàn),在正常情況下,HK的缺陷對炎癥因子的表達無影響。在大腸桿菌(108 CFU,200?l)腹腔注射6小時后,與Kng1+/+小鼠相比,Kng1-/-小鼠白細胞中炎癥因子TNF-α和IL-6的m RNA水平顯著升高(TNF-α:17.00±5.110 vs.83.20±9.640,p=0.0001;IL-6:70.61±38.39 vs.1374±348.4,p=0.0059;Kng1+/+vs.Kng1-/-)。以上結(jié)果提示,在細菌感染模型中,HK的缺陷可以上調(diào)白細胞中炎癥因子m RNA水平的表達;(6)大腸桿菌和小鼠血漿共孵育后,結(jié)合Western blotting檢測發(fā)現(xiàn),大腸桿菌可以與血漿中HK結(jié)合并且使HK發(fā)生裂解。當Kng1+/+和Kng1-/-小鼠血漿與細菌共孵育后,與Kng1+/+血漿相比,Kng1-/-血漿中細菌的數(shù)目有明顯增加(共孵育1小時:21110±4231 vs.47000±8825 CFU,p=0.0207;共孵育2小時:4020±613.9 vs.6910±122.7 CFU,p=0.0494;Kng1+/+vs.Kng1-/-),進一步運用純品HK與細菌共孵育,HK不被裂解,且細菌的數(shù)目與陰性對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義,提示,只有裂解后的HK具有抗菌作用。(7)大腸桿菌分別與含有PK抑制劑(DX-2930)和FXII抑制劑(CTI)的人的血漿共孵育后,含有抑制劑的血漿中HK不裂解。與正常血漿相比,抑制血漿中PK和FXII活性后導(dǎo)致細菌的清除率降低(共孵育10小時:39600±5913 vs.68600±7305 CFU,p=0.0128;共孵育20小時:22400±3473 vs.36800±4236 CFU,p=0.0302;正常血漿vs.含抑制劑血漿)。以上結(jié)果提示HK的殺菌作用依賴于KKS的活化�！窘Y(jié)論】本研究說明在宿主防御細菌感染中,血漿高分子量激肽原通過KKS的活化發(fā)生裂解釋放抗菌片段,從而發(fā)揮保護作用。
【關(guān)鍵詞】：血漿高分子量激肽原 宿主防御 細菌感染 組織損傷 細菌清除
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-14
• 材料和方法14-23
• 1. 實驗材料14-16
• 1.1 主要試劑14
• 1.2 實驗儀器14-15
• 1.3 主要試劑的配制15-16
• 1.4 實驗動物16
• 2. 實驗方法16-23
• 2.1 Kng1-/-小鼠模型的建立及鑒定16-17
• 2.2 Kng1-/-小鼠鑒定17-18
• 2.3 大腸桿菌的培養(yǎng)18-19
• 2.4 小鼠生存曲線19
• 2.5 組織切片及H&E染色19-20
• 2.6 腹腔、血液及組織中細菌計數(shù)20
• 2.7 炎癥因子含量的檢測20-21
• 2.8 檢測大腸桿菌與血漿HK的結(jié)合21
• 2.9 檢測大腸桿菌對血漿HK的裂解21
• 2.10 體外檢測HK殺菌作用21
• 2.11 檢測PK、FXII抑制劑對血漿HK裂解的抑制21-22
• 2.12 Western blotting檢測方法22
• 2.13 檢測抑制PK和FXII活性后血漿的殺菌作用22
• 2.14 統(tǒng)計學(xué)方法22-23
• 實驗結(jié)果23-32
• 1. Kng1-/- 小鼠模型的建立和鑒定23-25
• 1.1 Kng1-/- 小鼠模型的建立23-24
• 1.2 Kng1-/- 小鼠模型的鑒定24-25
• 2. 細菌感染模型中，HK缺陷促進小鼠死亡25
• 3. 盲腸結(jié)扎穿孔模型中，HK的缺陷促進肺和肝組織損傷25-27
• 4. 細菌感染模型中，HK的缺陷降低小鼠體內(nèi)細菌的清除27-28
• 5. 細菌感染模型中，，HK的缺陷上調(diào)白細胞中炎癥因子mRNA水平28
• 6. 血漿HK能與大腸桿菌結(jié)合并裂解28-30
• 7. 血漿HK的裂解能促進大腸桿菌清除30
• 8. 血漿HK的裂解的殺菌作用依賴于KKS的活化30-32
• 討論32-34
• 結(jié)論34-35
• 參考文獻35-39
• 綜述39-50
• 參考文獻45-50
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文50-51
• 英文縮略詞51-52
• 致謝52-53

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本文編號：589342