本文關(guān)鍵詞：狂犬病病毒M蛋白與細(xì)胞傳播性相關(guān)的功能位點(diǎn)分析

  更多相關(guān)文章： 狂犬病病毒 M蛋白 反向遺傳技術(shù) 細(xì)胞間傳播能力 Ⅰ型干擾素

【摘要】：狂犬病病毒(Rabies virus, RABV)具有嚴(yán)格的神經(jīng)嗜性,可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System, CNS)發(fā)生退行性疾病,死亡率居高不下,全球每年因其死亡人數(shù)高達(dá)70,000人,是全社會必須關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。目前只能做好暴露前和暴露后預(yù)防才能有效控制狂犬病病毒的傳播,除加強(qiáng)對人的免疫外,同時亦要加強(qiáng)對家養(yǎng)及野生動物的管理。狂犬病病毒基因組擁有5個開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF),依次編碼N、P、M、G和L蛋白,其中M蛋白參與病毒的出芽與釋放,同時具有調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的作用。本研究小組先前選取廣西的街毒株GX01株為研究對象,探索其M基因?qū)Σ《旧飳W(xué)特性的影響。GX01株為廣西分離強(qiáng)毒株,腦內(nèi)注射能100%致死成年小鼠。選取日本動物用狂犬病疫苗株RC-HL株的全長感染性cDNA克隆為骨架,RC-HL株為實(shí)驗(yàn)室固定的弱毒株,不致死成年小鼠。將GX01株M基因的44-46位氨基酸區(qū)域替換到rRC-HL的相應(yīng)位置,證實(shí)可明顯地影響病毒在細(xì)胞間的傳播特性為進(jìn)一步查明導(dǎo)致狂犬病病毒在細(xì)胞間傳播性降低的功能性氨基酸,針對M蛋白44和46位氨基酸殘基分別進(jìn)行F44L、S46G和F44L/S46G突變,運(yùn)用反向遺傳技術(shù)拯救出3個突變病毒,即rRC-HL(M44)株、rRC-HL(M46)株和rRC-HL (M44/46)株,然后測定其在細(xì)胞間的傳播特性。對親本病毒rRC-HL株、重組病毒rRC-HL (GX01M)株、突變病毒rRC-HL (M44)株、rRC-HL (M46)株和rRC-HL (M44/46)株及強(qiáng)毒株GX01株進(jìn)一步測定其生物學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)表明,在BSR/T7-9細(xì)胞上,重組病毒rRC-HL (GX01M)株和突變病毒rRC-HL (M44/46)株的病毒滴度顯著低于親本病毒rRC-HL株的病毒滴度,而高于強(qiáng)毒株GX01株。通過空斑試驗(yàn)表明親本毒株rRC-HL株在BSR/T7-9細(xì)胞間的傳播能力最強(qiáng),rRC-HL(GX01M)株、rRC-HL(M44)株、rRC-HL(M46)株和rRC-HL (M44/46)株分別比親本病毒rRC-HL株低1.8、1.5、1.3、2.6倍,街毒株GX01株比rRC-HL株低15.6倍,傳播能力最低。這些結(jié)果說明M蛋白的F44L/S46G聯(lián)合突變能夠顯著降低病毒在細(xì)胞間的傳播能力。各病毒株感染BSR/T7-9細(xì)胞48 hpi時,親本毒株rRC-HL株和rRC-HL (M46)株可誘導(dǎo)產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變(CPE),rRC-HL (M44)株可產(chǎn)生輕度的CPE,但是突變株rRC-HL (GX01M)株、rRC-HL (M44/46)株與GX01株一樣不誘導(dǎo)產(chǎn)生CPE,說明M蛋白的F44L/S46G聯(lián)合突變可明顯降低病毒產(chǎn)生CPE。重組病毒rRC-HL (GX01M)株、rRC-HL (M44)株、rRC-HL (M46)株和rRC-HL (M44/46)株與親本病毒rRC-HL株一樣不致死成年小鼠,只是造成小鼠4-8 d體重下降,之后恢復(fù)至正常水平,GX01株在第7天全部致死小鼠。說明GX01株的M蛋白不是主要毒力決定因子,M蛋白的F44L/S46G聯(lián)合突變亦不能明顯增強(qiáng)致病性。各病毒株以0.1 MOI的病毒量感染BSR/T7-9細(xì)胞后,rRC-HL (M46)株與rRC-HL株的N和M基因mRNA水平相似,高于其他病毒株,其中突變病毒rRC-HL (M44/46)株的N和M基因mRNA水平下降較明顯,僅次于街毒株GX01株。N和M蛋白水平與mRNA水平保持一致,rRC-HL株與rRC-HL (M46)株的N和M蛋白表達(dá)量均較高,rRC-HL (GX01M)株和rRC-HL (M44)株次之,rRC-HL(M44/46)株的N和M蛋白表達(dá)量顯著低于rRC-HL株,與先前的rRC-HL(GX01M2)株結(jié)果相似,GX01株的蛋白表達(dá)量最低�？袢∪醵局阹RC-HL株、rRC-HL (GX01M)株、rRC-HL (M44)株、rRC-HL (M46)株和rRC-HL (M44/46)株均能在RAW264.7細(xì)胞及TLR3敲除的RAW264.7細(xì)胞(RAW264.7 TLR3-/-細(xì)胞)上生長,而GX01株在RAW264.7細(xì)胞中受到高度的抑制。TLR3敲除后致使各病毒滴度均下降,但在這兩種細(xì)胞中的病毒滴度均顯著低于在BSR/T7-9細(xì)胞。各病毒株在RAW264.7細(xì)胞及RAW264.7 TLR3-/-細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)水平與在B SR/T7-9細(xì)胞中的趨勢相似。用ELISA方法檢測各病毒株感染細(xì)胞后誘導(dǎo)產(chǎn)生的I型干擾素(I型IFN)的含量,發(fā)現(xiàn)在RAW264.7細(xì)胞中12 hpi時只有rRC-HL(M44/46)株能夠產(chǎn)生較高水平的IFN-α/β;在24 hpi時除GX01株外,其他毒株均誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-α/β,然而,rRC-HL(M44/46)株誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-α/β水平仍是最高的,IFN-α和IFN-β分別達(dá)到了2212.17 pg/mL和2036.66 pg/mL。在R AW264.7 TLR3-/-細(xì)胞中,感染病毒12 hpi時,rRC-HL(GX01M)株、rRC-HL(M44)株和rRC-HL(M44/46)株產(chǎn)生較高水平的IFN-α/β,IFN-α分別達(dá)到了532.5、2070.5和2168.6 pg/mL；除了GX01株外,各病毒株在24 hpi時誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-α/β水平幾乎一樣。這些結(jié)果表明,GX01株的M基因替換rRC-HL株M基因后能夠誘導(dǎo)高水平IFN-α/β的產(chǎn)生,而M蛋白的F44L/S46G聯(lián)合突變是決定M蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平IFN-α/β的主要原因；在正常的RAW264.7細(xì)胞與RAW264.7 TLR3-/-細(xì)胞中均能產(chǎn)生IFN-α/β說明TLR3的敲除不影響病毒誘導(dǎo)IFN-α/β的產(chǎn)生。在RAW264.7細(xì)胞和R AW264.7 TLR3-/-細(xì)胞中,感染各病毒株后誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白Viperin的量均與IFN-α/β的量呈正相關(guān),這說明IFN-α/β通過誘導(dǎo)Viperin蛋白的表達(dá),從而使細(xì)胞進(jìn)入抗病毒狀態(tài)。感染各病毒株后IRF3的蛋白水平與IFN-α/β和Viperin的表達(dá)量相一致,說明IRF3參與了調(diào)節(jié)IFN-α/β的產(chǎn)生過程。感染狂犬病病毒后,NF-κB在RAW264.7細(xì)胞上有所上調(diào),但在正常的RAW264.7細(xì)胞和R AW264.7 TLR3-/-細(xì)胞表現(xiàn)不說明NF-κB對IFN-α/β的產(chǎn)生不是必須的,有待進(jìn)一步驗(yàn)證NF-αB對誘導(dǎo)IFN-α/β的影響；MyD88無顯著變化,不介導(dǎo)IFN-α/β的產(chǎn)生。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病病毒 M蛋白 反向遺傳技術(shù) 細(xì)胞間傳播能力 Ⅰ型干擾素
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65;R373
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-30
• 1.1 狂犬病病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)15-17
• 1.1.1 狂犬病病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)15-16
• 1.1.2 狂犬病病毒的基因組結(jié)構(gòu)16-17
• 1.2 狂犬病病毒的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制17-18
• 1.3 狂犬病病毒M基因的相關(guān)研究18-23
• 1.3.1 M蛋白的結(jié)構(gòu)18
• 1.3.2 M蛋白與病毒裝配、出芽及釋放18-19
• 1.3.3 影響病毒出芽的M蛋白決定區(qū)域研究19-21
• 1.3.4 M蛋白與病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制21-22
• 1.3.5 M蛋白與細(xì)胞凋亡的關(guān)系22-23
• 1.4 狂犬病病毒與細(xì)胞因子的研究23-25
• 1.4.1 狂犬病病毒與趨化因子23-24
• 1.4.2 狂犬病病毒與干擾素24-25
• 1.5 狂犬病病毒的反向遺傳學(xué)研究及應(yīng)用25-28
• 1.5.1 狂犬病病毒的反向遺傳學(xué)研究系統(tǒng)25-26
• 1.5.2 狂犬病病毒的反向遺傳學(xué)應(yīng)用26-28
• 1.6 開展本研究的目的與意義28-30
• 第二章 狂犬病病毒M蛋白與細(xì)胞傳播性相關(guān)的功能位點(diǎn)分析30-51
• 2.1 材料30-33
• 2.1.1 細(xì)胞、病毒和小鼠30
• 2.1.2 質(zhì)粒30-31
• 2.1.3 主要儀器和試劑31
• 2.1.4 引物設(shè)計與合成31-33
• 2.2 方法33-36
• 2.2.1 狂犬病突變病毒cDNA感染性克隆的構(gòu)建33
• 2.2.2 狂犬病突變病毒的拯救33-34
• 2.2.3 間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定拯救的突變病毒34
• 2.2.4 種毒的制備及毒價測定34-35
• 2.2.5 突變病毒M基因的鑒定35
• 2.2.6 多步生長曲線的測定35
• 2.2.7 病毒的空斑形成試驗(yàn)35
• 2.2.8 病毒的致病性實(shí)驗(yàn)35
• 2.2.9 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western Blot)35-36
• 2.2.10 實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)36
• 2.3 結(jié)果36-47
• 2.3.1 感染性cDNA克隆的構(gòu)建36-38
• 2.3.2 突變病毒的拯救38
• 2.3.3 突變病毒滴度的測定38-39
• 2.3.4 M基因突變位點(diǎn)序列鑒定39-40
• 2.3.5 拯救的狂犬病病毒生長特性40-41
• 2.3.6 突變病毒在細(xì)胞與細(xì)胞間的傳播能力41-42
• 2.3.7 突變病毒對細(xì)胞的影響42-43
• 2.3.8 突變病毒對小鼠的致病性43-44
• 2.3.9 突變病毒的蛋白水平變化44-45
• 2.3.10 突變病毒N和M基因的轉(zhuǎn)錄水平45-47
• 2.4 討論47-50
• 2.5 小結(jié)50-51
• 第三章 狂犬病病毒M蛋白介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素應(yīng)答51-78
• 3.1 材料與方法51-53
• 3.1.1 細(xì)胞、病毒51
• 3.1.2 主要試劑與儀器51
• 3.1.3 引物設(shè)計51-52
• 3.1.4 ELISA檢測IFN-α和IFN-β的操作步驟52-53
• 3.2 結(jié)果53-72
• 3.2.1 狂犬病病毒在RAW264.7細(xì)胞中的生長情況、mRNA水平與蛋白水平53-56
• 3.2.2 狂犬病病毒在RAW264.7 TLR3~(-/-)細(xì)胞中的生長情況、mRNA水平與蛋白水平56-58
• 3.2.3 狂犬病病毒在不同細(xì)胞上轉(zhuǎn)錄能力的比較58-60
• 3.2.4 突變病毒誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生60-63
• 3.2.5 突變病毒誘導(dǎo)IFN刺激基因Viperin的產(chǎn)生63-66
• 3.2.6 突變病毒誘導(dǎo)Ⅰ型IFN產(chǎn)生的相關(guān)基因分析66-69
• 3.2.7 感染狂犬病病毒的小鼠腦組織IFN-α/β的產(chǎn)生情況69-72
• 3.3 討論72-77
• 3.4 小結(jié)77-78
• 第四章 結(jié)論78-79
• 參考文獻(xiàn)79-89
• 致謝89

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1 韓改會;李回;孟先明;羅廷榮;;狂犬病病毒L蛋白的研究進(jìn)展[J];廣西畜牧獸醫(yī);2010年02期

2 張茂林;關(guān)振宏;段銘;黃英玉;王歡平;孟銳奇;;幾種糖對4℃貯存狂犬病病毒穩(wěn)定性的影響[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2010年05期

3 梁秀梅，，于潛;狂犬病病毒和狂犬病[J];生物學(xué)通報;1994年06期

4 陳鵬峰;也談犬與狂犬病[J];上海實(shí)驗(yàn)動物科學(xué);1995年02期

5 ;應(yīng)用免疫熒光抗體技術(shù)檢測豬的狂犬病病毒[J];農(nóng)業(yè)科技通訊;1997年09期

6 張海,金昌德,李六金,施新猷,婁清林,李秦;狂犬病病毒3aG株糖蛋白重組質(zhì)粒構(gòu)建及其體液免疫的研究[J];中國獸醫(yī)科技;2002年03期

7 姜海龍;錢愛東;;狂犬病病毒糖/核融合基因原核表達(dá)克隆質(zhì)粒的構(gòu)建與分析[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2005年06期

8 李影;段銳;錢愛東;;鹿源狂犬病野毒8202株基因型的研究[J];經(jīng)濟(jì)動物學(xué)報;2005年04期

9 張永振;熊成龍;鄒洋;王定明;余春;周敬祝;王昭孝;張永榮;;貴州省安龍縣狂犬病的流行病學(xué)研究[J];Virologica Sinica;2006年04期

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2 羅廷榮;;廣西狂犬病流行現(xiàn)狀[A];2010全國狂犬病防控高層論壇論文集[C];2010年

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