發(fā)布時(shí)間：2017-07-28 16:13

  本文關(guān)鍵詞：Triciribine在dHL-60細(xì)胞極性化中的作用研究

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【摘要】：研究背景急性或化膿性感染、中毒、惡性腫瘤、組織損傷等病理生理過(guò)程,均與嗜中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear leukocyte, PMNs)的定向遷移有關(guān),而中性粒細(xì)胞的定向遷移與其極性和趨化性關(guān)系密切。中性粒細(xì)胞能夠感知前后端不超過(guò)2%的趨化物濃度差異,進(jìn)而通過(guò)信號(hào)放大效應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)部激活大量的信號(hào)分子,引起蛋白和細(xì)胞器的重新分布,特別是F-actin和Myosin等細(xì)胞骨架的重構(gòu)。最終導(dǎo)致細(xì)胞形狀的變化,形成頭部寬鈍的片足和尾部窄長(zhǎng)的尾足,即為中性粒細(xì)胞的極性化。正是在此基礎(chǔ)上,通過(guò)片足的不斷前伸和尾足與基質(zhì)的不斷黏連和解離,中性粒細(xì)胞能夠穿越血管壁,向感染位置遷移和募集,即為細(xì)胞的趨化效應(yīng)。常見(jiàn)的趨化物有來(lái)自細(xì)菌的多肽甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰(fMLP)、白細(xì)胞介素8(IL-8)和補(bǔ)體成分c5a等,其中fMLP作用最強(qiáng)。Akt是分子量大約為60kD的絲/蘇氨酸蛋白激酶,約由480個(gè)氨基酸殘基組成,結(jié)構(gòu)上分為N端(PH結(jié)構(gòu)域)、中心催化結(jié)構(gòu)域和C端(與PK調(diào)節(jié)區(qū)類(lèi)似的區(qū)域)。Akt具有三種異構(gòu)體：Akt1/PKBα、Akt2/PKBβ和Akt3/PKBγ。磷酸化是Akt激活的主要機(jī)制,其調(diào)節(jié)主要依賴(lài)于磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-Akt-磷酸肌醇依賴(lài)性激酶(PDK)信號(hào)通路。Akt有兩個(gè)磷酸化位點(diǎn),分別位于催化域和調(diào)節(jié)域,即Thr308和Ser473,其完全激活需要兩個(gè)位點(diǎn)都被磷酸化。小G蛋白,因分子量只有20～30KD而得名,由于具有GTP酶活性,能在多種細(xì)胞反應(yīng)中充當(dāng)開(kāi)關(guān)的作用。小G蛋白的共同特點(diǎn)是,當(dāng)結(jié)合了GTP后即成為可活化下游分子的活化狀態(tài),而當(dāng)GTP被其自身水解為GDP時(shí)則恢復(fù)到非活化狀態(tài)。我們實(shí)驗(yàn)涉及的小G蛋白主要是Rho家族,包括Racl、Rac2、Cdc42和rhoA等。其在細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成過(guò)程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用,能調(diào)節(jié)胞漿中微絲肌動(dòng)蛋白的聚合或解聚,從而影響細(xì)胞形態(tài)。已知,PI3K/Akt是中性粒細(xì)胞極性化過(guò)程中F-actin等聚合和解聚推動(dòng)片足和尾足形成所謂正反饋環(huán)的基礎(chǔ),通過(guò)PI2k/Akt和Rho家族的小G蛋白的相互加強(qiáng)作用,形成朝向趨化物高濃度的前后極細(xì)胞軸。PI3K/Akt還可通過(guò)抑制包括Bad等凋亡基因的產(chǎn)生,進(jìn)而在細(xì)胞凋亡的發(fā)生與調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。多數(shù)腫瘤都伴隨有Akt豐度的增高,持續(xù)的Akt磷酸化活性增高與人類(lèi)腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、遷移、浸潤(rùn)關(guān)系密切,也是化療藥物療效不佳的一個(gè)重要原因。曲西立濱(Triciribine, TCN)是DNA合成抑制劑,能抑制Akt活性,具有廣譜抗腫瘤細(xì)胞增殖作用。目前已有文獻(xiàn)證實(shí),在急性髓性白血病治療,TCN已經(jīng)進(jìn)入到Ⅰ/Ⅱ期的臨床研究,但TCN對(duì)從早幼粒白血病細(xì)胞(HL-60)誘導(dǎo)分化成的類(lèi)中性粒細(xì)胞(dHL-60)極性化和凋亡的影響及機(jī)制,目前仍缺乏相關(guān)研究支持。目的本研究旨在先后通過(guò)不同濃度TCN和均勻濃度的fMLP分別處理dHL-60細(xì)胞,觀察不同濃度TCN作用于Akt/Rho GTPases通路對(duì)dHL-60細(xì)胞極性化的抑制作用；并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)、Western blot和GST pull-down等方法,分別檢測(cè)不同濃度TCN對(duì)dHL-60的細(xì)胞凋亡以及Akt和小G蛋白活性的影響。方法1.復(fù)蘇后經(jīng)傳2代的HL-60細(xì)胞,培養(yǎng)到細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,收集1.5×105個(gè)HL-60細(xì)胞置于15ml含1.25%DMSO的誘導(dǎo)分化液中,在37℃、含5%CO2的孵育箱進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)分化4d,進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。2.用Zigmond小室建立fMLP濃度梯度為0-100nM,在此濃度梯度下,觀察不同濃度TCN預(yù)處理dHL-60細(xì)胞所引起的定向極性化表現(xiàn)的改變。3.采用免疫熒光技術(shù)在激光共聚焦顯微鏡下觀察5μMTCN對(duì)均勻濃度f(wàn)MLP刺激的F-actin極性分布的影響。4.用GST-pull down方法檢測(cè)TCN對(duì)均勻濃度f(wàn)MLP誘導(dǎo)Cdc42,Rac2活化的影響。5.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度TCN (0、5、60、80μM)誘導(dǎo)dHL-60細(xì)胞的凋亡率。6.用western blot檢測(cè)不同濃度TCN (0、O.1、1、 5、10、 20、40、60、80、100μM)預(yù)處理dHL-60細(xì)胞后對(duì)均勻濃度f(wàn)MLP誘導(dǎo)的Akt磷酸化活性的影響。并針對(duì)5μM和60μMTCN,在不同時(shí)間點(diǎn)(0、15、30、60 min)及有和無(wú)均勻濃度f(wàn)MLP處理的條件下,分別探究其對(duì)dHL-60細(xì)胞Akt磷酸化活性的影響。7.采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)在激光共聚焦顯微鏡下觀察5μM濃度的TCN預(yù)處理對(duì)Akt向膜上募集的影響。8.實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,數(shù)據(jù)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析(one-way ANOVA)分析。多組間的兩兩比較時(shí)先采用Homogeneity-of-variance test檢驗(yàn)方差齊性,若方差齊(P0.05)采用LSD法,若方差不齊(P0.05)則采用Dunnett, T3法。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.與對(duì)照組相比,經(jīng)fMLP刺激后的dHL-60細(xì)胞極性化率顯著升高,TCN預(yù)處理dHL-60細(xì)胞后,與未預(yù)處理組相比,fMLP刺激的細(xì)胞極性化率隨著TCN濃度升高而降低。當(dāng)TCN濃度為5μM時(shí),與單獨(dú)fMLP刺激組相比,細(xì)胞極性化顯著減弱,尾足也明顯變短,且極性化方向不定。TCN升高到10μM時(shí),dHL-60細(xì)胞尾足消失,極性化不明顯。2.靜息狀態(tài)下,F-actin均勻分布在胞質(zhì)膜上。用均一濃度為100nM的fMLP刺激5min后,dHL-60細(xì)胞發(fā)生明顯的極性形態(tài)變化,F-actin呈極性分布在質(zhì)膜上,聚集在細(xì)胞的片足或偽足上,且熒光增強(qiáng)；用TCN預(yù)處理1h后則明顯抑制了fMLP所刺激的F-actin極性分布,同細(xì)胞靜息狀態(tài)下的表現(xiàn)相似。3.與對(duì)照組相比,經(jīng)fMLP刺激的dHL-60細(xì)胞的Cdc42, Rac2活化水平顯著性上調(diào),用5μM TCN預(yù)處理dHL-60細(xì)胞1h后,與未預(yù)處理組相比,fMLP刺激引起的Rac2, Cdc42的活化水平顯著降低。4.不同濃度TCN (0、5、60、80μM)預(yù)處理dHL-60細(xì)胞1h后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)細(xì)胞凋亡率隨著TCN濃度升高也升高。5.單獨(dú)fMLP作用可引起Akt在T308和S473兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)均出現(xiàn)明顯的磷酸化,在5μM TCN預(yù)處理dHL-60細(xì)胞1h后Akt磷酸化開(kāi)始被明顯抑制,且隨著TCN濃度提高,抑制效果越來(lái)越明顯。考慮到藥物可能的毒副作用,選TCN作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的TCN濃度。用TCN預(yù)處理dHL-60細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)(0、 15、30、60 min),再經(jīng)fMLP刺激,dHL-60細(xì)胞Akt的T308和S473位點(diǎn)磷酸化水平隨TCN作用時(shí)間延長(zhǎng)而降低。6.細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示：經(jīng)fMLP刺激的dHL-60細(xì)胞Akt向膜上募集,而予5μM TCN預(yù)處理可以阻止Akt向膜上的募集。結(jié)論低濃度TCN可經(jīng)Akt/Rho GTPases通路參與抑制dHL-60細(xì)胞極性化,高濃度TCN促進(jìn)dHL-60細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：Triciribine 細(xì)胞極性化 Akt
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-20
• 材料和方法20-33
• 1 實(shí)驗(yàn)材料20-25
• 1.1 細(xì)胞培養(yǎng)20
• 1.2 主要試劑20-21
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器21-22
• 1.4 主要溶液的配制22-25
• 2 實(shí)驗(yàn)方法25-32
• 2.1 HL-60細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化25
• 2.2 人中性粒細(xì)胞分離25-26
• 2.3 細(xì)胞極性實(shí)驗(yàn)26-27
• 2.4 dHL-60細(xì)胞內(nèi)F-actin的免疫熒光測(cè)定27
• 2.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定dHL-60細(xì)胞的凋亡率27-28
• 2.6 GST pull down操作步驟28
• 2.7 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)28-32
• 3 結(jié)果分析32-33
• 結(jié)果33-44
• 1. DMSO誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化為dHL-60細(xì)胞33
• 2. TCN抑制fMLP誘導(dǎo)的dHL-60細(xì)胞的極性化33-36
• 3. TCN對(duì)人中性粒細(xì)胞的極性化影響36-37
• 4. TCN對(duì)dHL-60細(xì)胞內(nèi)聚合F-actin的影響37-38
• 5. TCN通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)活化Rac2和Cdc42蛋白的影響而抑制dHL-60細(xì)胞極性化38-39
• 6. 60-80μM TCN增加dHL-60細(xì)胞的凋亡39-41
• 7. TCN的不同量效關(guān)系與其抑制Akt磷酸化程度不同有關(guān)41-42
• 8. TCN抑制Akt向膜上的募集42-44
• 討論44-48
• 1. TCN在調(diào)節(jié)dHL-60細(xì)胞極性中的作用44-45
• 2. TCN在dHL-60細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用45-46
• 3. TCN在抗腫瘤研究中的作用46-48
• 全文小結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 致謝54-55
• 碩士期間發(fā)表論文55-56
• 英文縮略詞表56-58

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：584888