本文關(guān)鍵詞：脂聯(lián)素對大鼠成骨細(xì)胞成骨分化中TGF-β1和Runx2表達(dá)的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：原代培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞,探討成骨細(xì)胞受脂聯(lián)素作用后生物學(xué)行為的改變；檢測不同濃度脂聯(lián)素作用下成骨細(xì)胞TGF-β1和Runx2基因和蛋白表達(dá)的變化,探討脂聯(lián)素對骨改建的作用及其可能作用機(jī)制。方法：1、脂聯(lián)素對大鼠成骨細(xì)胞成骨分化的影響①、采用二次酶消化法進(jìn)行大鼠成骨細(xì)胞原代培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。經(jīng)礦化誘導(dǎo)14天后,用茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色,進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定；②、取第3-5代生長良好的成骨細(xì)胞,用濃度為4μg/ml脂聯(lián)素作用成骨細(xì)胞0、1、3、5、7、9d,采用MTT法檢測脂聯(lián)素對成骨細(xì)胞增殖活性的影響；③、取第3-5代成骨細(xì)胞,用濃度為4μg/ml脂聯(lián)素作用成骨細(xì)胞0、1、3、5、7、9d,檢測脂聯(lián)素對成骨細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶活性的影響；④、取第3-5代成骨細(xì)胞,分別用0、1、2、4、8μg/ml濃度脂聯(lián)素作用7d,使用ELISA法檢測TGF-β1和Runx2蛋白的表達(dá)水平；2、脂聯(lián)素對大鼠成骨細(xì)胞成骨分化作用通路的研究①、用濃度為5μmol/L的TGF-β1抑制劑SB431542,分別預(yù)處理成骨細(xì)胞15min、30min、1h、2h、4h,再加入濃度為4μg/ml脂聯(lián)素培養(yǎng)成骨細(xì)胞7d。分別用濃度為0、1、2.5、5、10、20μmol/L的TGF-β1抑制劑SB431542,預(yù)處理成骨細(xì)胞2h,再加入濃度為411 g/ml旨聯(lián)素培養(yǎng)成骨細(xì)胞7d。分別采用MTT法檢測TGF-β 1抑制劑SB431542對成骨細(xì)胞增殖活性的影響,確定TGF-β1抑制劑SB431542發(fā)揮作用的最適濃度和作用時(shí)間;②, ELISA法檢測TGF-β1抑制劑拮抗脂聯(lián)素對TGF-β1蛋白表達(dá)的影響。分為5組,對照組：不加入脂聯(lián)素,不加入SB431542; APN組：只加入濃度為4μg/ml的脂聯(lián)素；SB431542+APN組：用濃度為5μmol/L的SB431542預(yù)處理2h后,再加入濃度為4μg/ml的脂聯(lián)素；SB431542組：只用濃度為5μmol/L的SB431542預(yù)處理2h；DMSO組：加入DMSO。各組成骨細(xì)胞分別培養(yǎng)7d后,ELISA法檢測TGF-β1蛋白的表達(dá)；③、RT-qPCR法檢測TGF-β1抑制劑拮抗脂聯(lián)素對Runx2 mRNA表達(dá)的影響。分為5組,對照組：不加入脂聯(lián)素,不加入SB431542;APN組：只加入濃度為4μg/ml的脂聯(lián)素；SB431542+APN組：用濃度為5μmol/L的SB431542預(yù)處理2h后,再加入濃度為4μg/ml的脂聯(lián)素;SB431542組：只用濃度為5μmol/L的SB431542預(yù)處理2h；DMSO組：加入DMSO。各組成骨細(xì)胞分別培養(yǎng)7d后,RT-qPCR檢測Runx2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：1、脂聯(lián)素對大鼠成骨細(xì)胞成骨分化的影響①倒置顯微鏡觀察,成骨細(xì)胞接種24 h后細(xì)胞充分鋪展,形態(tài)多樣,呈三角形、梭形、多角形等不規(guī)則形。細(xì)胞爬滿瓶底后可呈復(fù)層生長,并在局部聚集成灶,形成鈣結(jié)節(jié),通過茜素紅染色法可使鈣結(jié)節(jié)染成橘紅色。②MTT結(jié)果顯示：脂聯(lián)素作用成骨細(xì)胞后,0D值持續(xù)升高,在7d達(dá)到高峰(P0.05),之后便呈下降趨勢,時(shí)間到9d時(shí),0D值仍高于對照組(P0.05)。③堿性磷酸酶活性檢測顯示：脂聯(lián)素作用成骨細(xì)胞后,堿性磷酸酶活性逐漸增高,在7d達(dá)最高水平(P0.05),之后便呈下降趨勢,時(shí)間到9d時(shí),0D值仍高于對照組(P0.05)。④ELISA檢測顯示：成骨細(xì)胞在不同濃度脂聯(lián)素作用后,TGF-β1和Runx2蛋白的表達(dá)均上調(diào),濃度在4μg/ml時(shí),TGF-β1和Runx2蛋白的表達(dá)量最高,各組組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2、脂聯(lián)素對大鼠成骨細(xì)胞成骨分化作用機(jī)制的研究①M(fèi)TT檢測顯示：用不同濃度的TGF-β1抑制劑SB431542,分別預(yù)處理成骨細(xì)胞不同時(shí)間后,0D值均下降,0D值在抑制劑濃度為5μmol/L,作用時(shí)間為2h時(shí)最低(P0.05),各組組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(9)ELISA檢測顯示：APN組可明顯上調(diào)TGF-β1蛋白的表達(dá),與對照組比較(P0.05); SB431542+APN組可顯著阻斷脂聯(lián)素對TGF-β1蛋白表達(dá)的上調(diào)作用,APN組與SB431542+APN組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；對照組、SB431542組、DMSO組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。③RT-qPCR檢測顯示：與對照組相比,APN組可明顯上調(diào)Runx2 mRNA的表達(dá)(P0.05); SB431542+APN組可明顯降低脂聯(lián)素對Runx2 mRNA表達(dá)的上調(diào)作用,APN組與SB431542+APN組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；對照組、SB431542組、DMSO組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論：1、脂聯(lián)素作用成骨細(xì)胞后,可通過增加TGF-β1和Runx2的合成,促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟和分化,進(jìn)而參與調(diào)節(jié)骨改建。2、TGF-β1抑制劑阻斷脂聯(lián)素對成骨細(xì)胞TGF-β1和Runx2表達(dá)的上調(diào)作用,TGF-β1和Runx2表達(dá)呈明顯下降趨勢。提示Runx2作為TGF-β1的下游信號(hào)分子,介導(dǎo)了脂聯(lián)素誘導(dǎo)大鼠成骨細(xì)胞在成骨分化中TGF-β1的信號(hào)傳遞,參與了脂聯(lián)素促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的成骨分化。
【關(guān)鍵詞】：脂聯(lián)素 成骨細(xì)胞 TGF-β1 Runx2
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 個(gè)人簡歷3-5
• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 第一部分 脂聯(lián)素對大鼠成骨細(xì)胞成骨分化的影響17-31
• 1 實(shí)驗(yàn)材料17
• 2 實(shí)驗(yàn)方法17-21
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-27
• 4 討論27-30
• 5 小結(jié)30-31
• 第二部分 脂聯(lián)素對大鼠成骨細(xì)胞成骨分化作用通路的研究31-41
• 1 實(shí)驗(yàn)材料31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-34
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-38
• 4 討論38-40
• 5 小結(jié)40-41
• 全文總結(jié)41-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 綜述46-58
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 臨床病例報(bào)告58-68
• 致謝68-70
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文70

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