本文關(guān)鍵詞：Nrf2重組慢病毒對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和分化的影響及小鼠ACLT骨關(guān)節(jié)炎模型的建立與鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(NF-E2 related factor,Nrf2)重組慢病毒(lentivirus),靶向Nrf2和ATF4(activating transcription factor 4)的si RNA重組慢病毒顆粒;探究Nrf2基因的重組慢病毒修飾對(duì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞及軟骨骨細(xì)胞分化過(guò)程中增殖、凋亡和分化的影響;建立小鼠膝蓋前交叉韌帶切除術(shù)(anterior cruciate ligament transection,ACLT)的骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病模型。方法將載有目的基因Nrf2序列的慢病毒骨架質(zhì)粒p WPT-GFP-Nrf2與p MD2G、p SPAX2慢病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞中,完成Nrf2慢病毒的包裝,同理設(shè)計(jì)并完成Lv-si Nrf2和Lv-ATF4慢病毒的構(gòu)建與包裝;在BMP2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中,設(shè)立不同的病毒處理組,檢測(cè)Nrf2及ATF4對(duì)C2C12細(xì)胞增殖、凋亡及分化的影響;高密度微團(tuán)培養(yǎng)C3H10細(xì)胞,并在BMP2處理下誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化,檢測(cè)Lv-Nrf2對(duì)C3H10向軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中增殖和凋亡的影響,胎鼠腿骨組織體外培養(yǎng),設(shè)立不同病毒處理組,腿組織包埋切片后,Tunel染色檢測(cè)胎鼠軟骨組織的凋亡情況,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白在軟骨組織中的表達(dá)與分布;手術(shù)建立小鼠ACLT骨關(guān)節(jié)炎模型并對(duì)其進(jìn)行評(píng)估鑒定。結(jié)果成功包裝了重組慢病毒Lv-Nrf2、Lv-si Nrf2及Lv-si ATF4(滴度約為1×108efu/m L);BMP2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中,FCM的結(jié)果顯示,BMP2+Lv-Nrf2組細(xì)胞凋亡率低于BMP2+Lv-GFP組,BMP2+Lv-si Nrf2組細(xì)胞凋亡率高于BMP2+Lv-GFP組,BMP2+Lv-Nrf2+Lv-si ATF4組細(xì)胞凋亡率低于BMP2+Lv-GFP組并同時(shí)低于BMP2+Lv-si ATF4組;western結(jié)果與FCM凋亡結(jié)果一致;免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組BMP2+Lv-Nrf2組中骨鈣蛋白(Osteocalcin,OCN)與堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)表達(dá)增高,而B(niǎo)MP2+Lv-si Nrf2組中兩種蛋白表達(dá)均降低,聯(lián)合處理組BMP2+Lv-Nrf2+Lv-si ATF4中兩種蛋白表達(dá)低于對(duì)照組和BMP2+Lv-Nrf2組;在BMP2誘導(dǎo)微團(tuán)培養(yǎng)的C3H10細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中,FCM的結(jié)果顯示,與空病毒處理組相比,Lv-Nrf2組C3H10凋亡率下降,細(xì)胞中占S期的細(xì)胞比例上升;western結(jié)果與FCM結(jié)果一致;Tunel細(xì)胞熒光染色結(jié)果顯示,與空病毒處理組相比,Lv-Nrf2處理組細(xì)胞凋亡率顯著下降;Tunel熒光及組織化學(xué)染色對(duì)胎鼠腿骨石蠟切片進(jìn)行染色,結(jié)果顯示,與Lv-GFP處理組相比,Lv-Nrf2可以減少胎鼠腿骨組織中軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生;成功在野生型小鼠和PGRN缺陷型小鼠中建立ACLT骨關(guān)節(jié)炎模型;PGRN缺陷型小鼠比野生型小鼠ACLT手術(shù)后,骨關(guān)節(jié)炎的癥狀更加嚴(yán)重。結(jié)論一方面,在BMP2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞成骨分化過(guò)程中,Nrf2基因可抑制C2C12細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)其向成骨分化,同時(shí),可挽回因ATF4蛋白減少而產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡;另一方面,在BMP2誘導(dǎo)微團(tuán)培養(yǎng)的C3H10細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中,Nrf2可抑制C3H10細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)細(xì)胞的增殖,對(duì)軟骨組織的細(xì)胞具有一定保護(hù)作用;小鼠ACLT模型在構(gòu)建后8周時(shí),關(guān)節(jié)炎的癥狀最為明顯,PGRN基因可能參與關(guān)節(jié)軟骨的損傷修復(fù),可能參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過(guò)程。
【關(guān)鍵詞】：Nrf2 慢病毒 骨細(xì)胞 分化
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R684.3;R-332
【目錄】：

• 符號(hào)說(shuō)明4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-11
• 第一部分：重組慢病毒的構(gòu)建與包裝11-20
• 1 材料與方法11-17
• 2 結(jié)果17-19
• 3 討論19-20
• 第二部分：Nrf2對(duì)C2C12細(xì)胞增殖，凋亡和分化的影響20-29
• 1 材料與方法20-22
• 2 結(jié)果22-27
• 3 討論27-29
• 第三部分：軟骨細(xì)胞分化中LV-Nrf2對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡的影響29-39
• 1 材料與方法29-32
• 2 結(jié)果32-38
• 3 討論38-39
• 第四部分：小鼠ACLT骨關(guān)節(jié)炎模型的構(gòu)建與鑒定39-50
• 1 材料與方法39-42
• 2 結(jié)果42-48
• 3 討論48-50
• 全文總結(jié)與討論50-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 文獻(xiàn)綜述56-67
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 史晨輝;王維山;李長(zhǎng)俊;張振東;郭風(fēng)勁;陳安民;;慢病毒介導(dǎo)uPA-siRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建及促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞增殖[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2014年05期

2 許朝;胡端敏;諸琦;;EEF1A2基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及慢病毒表達(dá)系統(tǒng)的建立[J];生物學(xué)雜志;2013年02期

3 韓騰龍;王立峰;張t

本文編號(hào)：430501