本文關(guān)鍵詞：小核仁RNA在維持人多能干細(xì)胞自我更新中的作用及機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【研究背景與目的】胚胎干細(xì)胞(ESC)是多能干細(xì)胞中多能性最強(qiáng)的細(xì)胞系,具有廣闊的研究以及應(yīng)用前景[1]。然而由于胚胎干細(xì)胞多能性的維持機(jī)制復(fù)雜,目前尚未明確,使得胚胎干細(xì)胞的實(shí)際應(yīng)用受到限制[2]。與之相比,臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(uMSCs)多能性水平相對(duì)較低,卻是一類頗受重視的多能性細(xì)胞,已成為再生醫(yī)學(xué)細(xì)胞治療中有前景的候選者[3,4]。目前,uMSCs在部分疾病治療中的應(yīng)用已得到FDA批準(zhǔn)[5]。但是,一些潛在的問(wèn)題的存在限制了其應(yīng)用。眾所周知[4,6-8],臨床應(yīng)用級(jí)uMSCs需要具有高活性,且需要量大,而在體外培養(yǎng)條件下uMSCs擴(kuò)增代數(shù)有限,一旦超出這個(gè)范圍細(xì)胞將會(huì)出現(xiàn)分化或者老化,細(xì)胞的生物學(xué)活性顯著降低,在疾病治療中的價(jià)值也隨之喪失。因此,保持細(xì)胞的自我更新能力,維持其增殖活性,抑制其分化是未來(lái)間充質(zhì)干細(xì)胞研究的重點(diǎn),對(duì)其臨床應(yīng)用價(jià)值的判定具有重要意義。近期研究證實(shí),小核仁RNA(small noculear RNA,snoRNA)在細(xì)胞增殖過(guò)程中具有重要作用[9],這為我們提供了新思路。遺憾的是關(guān)于此類功能的研究主要集中在腫瘤細(xì)胞增殖中,而有關(guān)snoRNA與干細(xì)胞調(diào)控之間的相關(guān)性卻幾無(wú)報(bào)道。另外,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)部分特殊snoRNAs經(jīng)切割可生成更小的功能性RNAs,即snoRNAs衍生RNAs[10,11](snoRNAs derived RNAs,sdRNAs),這些sdRNAs中部分具有微小RNAs(microRNAs,miRNAs)的特征[11,12],可發(fā)揮類似miRNA的作用,這一發(fā)現(xiàn)極大地拓展了snoRNAs的作用機(jī)制方式。本組研究的目的在于探究一些特殊snoRNAs及其sdRNAs在干細(xì)胞中的自我更新維持中的作用及機(jī)制。第一部分:C/Dbox SnoRNA3A(U3)促進(jìn)hESCs多能性方法:(1)通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)hESC分化前后差異表達(dá)的snoRNA。通過(guò)Northern Blot鑒定C/Dbox snoRNA3A(SNORD3A,U3)、SNORD58(C/Dbox snoRNA58A)及snoRD69(C/Dbox snoRNA69)的內(nèi)源性表達(dá)情況。(2)在hESCs中進(jìn)行過(guò)表達(dá)和抑制U3、U3-sd RNA,通過(guò)Real-time PCR、AP染色等試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)hESCs多能性的影響。(3)通過(guò)FISH及核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)檢測(cè)U3-sd RNA在hESCs中的分布情況。(4)構(gòu)建體外切割體系及核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)研究U3具體產(chǎn)生位置(5)構(gòu)建U3突變體檢測(cè)U3-sd RNA的形成規(guī)律。結(jié)果:(1)Northern Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高通量分析中表達(dá)量變化顯著的U3在不同分化程度的細(xì)胞系中表達(dá)差異不顯著,但其衍生small RNA在不同細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)量呈現(xiàn)為hESCsuMSCs293T。(2)U3和U3-sd RNA過(guò)表達(dá)的hESCs多能性基因表達(dá)量均顯著增高,克隆顯著增多,而抑制U3-sd RNA后結(jié)果相反(3)FISH與核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)顯示,U3-sd RNA胞核內(nèi)含量顯著低于胞質(zhì)。(4)體外切割后Northern Blot鑒定顯示,hESCs胞質(zhì)與U3共孵育可產(chǎn)生更多U3-sd RNA(5)6組突變體過(guò)表達(dá)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Mut-1、Mut-2組細(xì)胞產(chǎn)生克隆數(shù)與對(duì)照組無(wú)明顯差異。其他四種類型突變體過(guò)表達(dá)后均可以顯著提高h(yuǎn)ESCs的克隆形成率結(jié)論:U3可以維持甚至提高胚胎干細(xì)胞多能性。這一作用主要通過(guò)在胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)酶切形成的sdRNA實(shí)現(xiàn)。另外,sdRNA的產(chǎn)生主要與snoRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。第二部分H/ACA SnoRNA7A促進(jìn)huMSCs的自我更新方法:(1)干擾H/ACA snoRNAs核心蛋白DKC1、NOP10后通過(guò)Real-time PCR、Western Blot等方法檢測(cè)uMSCs多能性及增殖能力的變化。(2)芯片數(shù)據(jù)檢測(cè)uMSCs分化前后差異表達(dá)的snoRNAs。(3)在uMSCs中進(jìn)行過(guò)表達(dá)和抑制SNORA7A通過(guò)Real-time PCR、Western Blot、EDU、克隆形成、細(xì)胞倍增時(shí)間等方法檢測(cè)其對(duì)uMSCs多能性及增殖能力的影響。(4)構(gòu)建突變SNORA7A核心蛋白結(jié)合位點(diǎn)的過(guò)表達(dá)載體,通過(guò)Real-time PCR、Western Blot、EDU、克隆形成、細(xì)胞倍增時(shí)間等試驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)uMSCs多能性及增殖能力的影響。(5)成脂和成骨誘導(dǎo)方法檢測(cè)SNORA7A對(duì)uMSCs分化的調(diào)控作用。結(jié)果:(1)H/ACA box SnoRNA在uMSCs增殖能力以及自我更新能力的維持中發(fā)揮重要作用(2)SNORA7A在調(diào)控uMSCs增殖活性發(fā)揮重要作用(3)過(guò)表達(dá)SNORA7A可以提高7A的自我更新能力(4)抑制SNORA7A可顯著抑制uMSCs自我更新能力(5)SNORA7A對(duì)uMSCs自我更新的調(diào)控主要通過(guò)功能單位snoRNP實(shí)現(xiàn)(6)DKC1是SNORA7A發(fā)揮作用的關(guān)鍵分子(7)SNORA7A具有抑制uMSCs成脂以及成骨分化的作用結(jié)論:內(nèi)源性SNORA7A在uMSCs的增殖以及自我更新過(guò)程中發(fā)揮重要作用。該作用主要通過(guò)形成snoRNP產(chǎn)生。同時(shí),SNORA7A在uMSCs體外培養(yǎng)狀態(tài)下自我更新能力的維持中起到至關(guān)重要的作用小結(jié)不同snoRNA在干細(xì)胞自我更新中發(fā)揮不同作用,且作用機(jī)制不同。U3可以維持甚至提高胚胎干細(xì)胞多能性。這一作用主要通過(guò)在胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)酶切形成的sdRNA實(shí)現(xiàn)。內(nèi)源性SNORA7A在uMSCs的增殖以及自我更新過(guò)程中發(fā)揮重要作用。該作用主要通過(guò)形成snoRNP產(chǎn)生。
【關(guān)鍵詞】：人胚胎干細(xì)胞 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 小RNA 小核仁RNA 自我更新 增殖 多能性
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-13
• 第一部分：C/Dbox SnoRNA3A(U3)促進(jìn)hESCs多能性13-33
• 一、前言13-15
• 二、材料與方法15-23
• 三、結(jié)果23-31
• 四、討論31-33
• 第二部分：H/ACA box小核仁RNA 7A對(duì)uMSCs的影響及機(jī)制研究33-57
• 一、前言33-34
• 二、材料與方法34-40
• 三、結(jié)果40-55
• 四、討論55-57
• 附錄57-60
• 文獻(xiàn)綜述 小核仁RNAs及其衍生RNAs的研究進(jìn)展60-67
• 前言60
• 一、SnoRNAs結(jié)構(gòu)、分類及其生物學(xué)功能60-62
• 二、snoRNAs衍生的sdRNA與miRNA之間相關(guān)性研究進(jìn)展62-66
• 三、snoRNAs的研究?jī)r(jià)值及臨床應(yīng)用66-67
• 參考文獻(xiàn)67-75
• 在讀期間論文發(fā)表和科研工作情況說(shuō)明75-76
• 致謝76-78

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本文編號(hào)：429180