本文關(guān)鍵詞：抗人胱抑素C單克隆抗體的制備及初步鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:制備抗重組人胱抑素C(cystatin C,Cys C)單克隆抗體,并測量其濃度,對其生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行一個(gè)初步鑒定(包括免疫反應(yīng)性、亞型、效價(jià)、相對親和力、是否能與天然蛋白結(jié)合)。為進(jìn)一步組裝Cys C臨床測量試劑盒,以及探究Cys C的其他生物學(xué)作用打下牢固的基礎(chǔ)。方法:以本實(shí)驗(yàn)室原核表達(dá)的人Cys C重組蛋白免疫BALB/c小鼠,在聚乙二醇1500的作用下使小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0發(fā)生融合,采用有限稀釋法篩選出穩(wěn)定分泌抗Cys C的雜交瘤細(xì)胞株(即陽性克隆),向BALB/c小鼠腹腔注入雜交瘤細(xì)胞,抽取小鼠產(chǎn)生的腹水,采用protein A親和層析柱純化腹水。測定單克隆抗體的濃度使用BCA法,測定單克隆抗體的免疫反應(yīng)性使用Western Blot,測定單克隆抗體的亞型、效價(jià)和相對親和力使用間接ELISA法。將辣根過氧化物酶(HRP)與單克隆抗體偶聯(lián),重組蛋白作為抗原篩選出最佳配對抗體,并用雙抗夾心法測定天然Cys C蛋白。結(jié)果:運(yùn)用經(jīng)典的單克隆抗體制備技術(shù),篩選出了抗Cys C單克隆抗體的7株雜交瘤細(xì)胞,分別命名為4E3、4G2、4E2、4H2、4G4、8E1、8G4。向小鼠腹腔注入雜交瘤細(xì)胞,獲得了抗Cys C單克隆抗體濃度很高的腹水。protein A親和層析柱純化腹水效果良好,測定已純化的抗體濃度最高的可達(dá)1.475mg/m L。7株單克隆抗體均有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性和較高的相對親和力,經(jīng)抗體亞型鑒定,其中5株為Ig G1型,2株為Ig G2a型。使用間接ELISA法檢測自主研發(fā)的抗體效價(jià)均可達(dá)1:104。采用雙抗夾心法,當(dāng)8E1作為包被抗體,8G4作為酶標(biāo)抗體的情況下,測得的OD值最高,使用此抗體對可以檢測出血清中的天然Cys C。結(jié)論:(1)創(chuàng)建了抗重組人Cys C單抗雜交瘤細(xì)胞庫,經(jīng)有限稀釋法篩選得到了7株抗Cys C單抗雜交瘤細(xì)胞。(2)通過雜交瘤培養(yǎng)技術(shù)和小鼠腹腔注射制備了大量的單克隆抗體,純化后對其生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步鑒定,證明了其具有良好的抗體反應(yīng)性及親和力。(3)醫(yī)院收集的天然Cys C可與自主研發(fā)的單克隆抗體相結(jié)合,為今后進(jìn)一步建立Cys C檢測方法,組裝商品化試劑盒打下了牢固的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：胱抑素C 單克隆抗體 特性鑒定
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392.11
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 前言10-14
• 第二章 材料與方法14-27
• 2.1 材料14-19
• 2.1.1 主要儀器14-15
• 2.1.2 主要試劑15-16
• 2.1.3 常用溶液配制16-18
• 2.1.4 ELISA相關(guān)試劑的配制18
• 2.1.5 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑18-19
• 2.2 方法19-27
• 2.2.1 重組胱抑素C對小鼠的免疫19-20
• 2.2.2 單克隆抗體的制備20-22
• 2.2.3 單克隆抗體的純化22-23
• 2.2.4 單克隆抗體的濃度測定23
• 2.2.5 單克隆抗體的性質(zhì)分析23-25
• 1）Western blotting鑒定抗體活性23-24
• 2）單克隆抗體的亞型分析24
• 3) 間接ELISA法測定單抗效價(jià)24
• 4) 相對親和力測定24-25
• 2.2.6 單克隆抗體標(biāo)酶及配對25-26
• 2.2.7 雙抗體夾心法檢測臨床血清標(biāo)本26-27
• 第三章 結(jié)果27-34
• 3.1 間接ELISA檢測免疫小鼠血清效價(jià)27
• 3.2 細(xì)胞融合27-28
• 3.3 抗重組胱抑素C單克隆抗體的篩選28
• 3.4 單克隆抗體的純化28-29
• 3.5 單克隆抗體蛋白濃度測定29-30
• 3.6 單克隆抗體的初步鑒定30-32
• 3.6.1 單克隆抗體的免疫反應(yīng)性檢測30
• 3.6.2 單克隆抗體的亞型分析30-31
• 3.6.3 間接ELISA鑒定單克隆抗體的效價(jià)31-32
• 3.6.4 相對親和力的測定32
• 3.7 單克隆抗體標(biāo)酶及配對32-33
• 3.8 雙抗體夾心法檢測臨床血清標(biāo)本33-34
• 第四章 討論34-39
• 1、動(dòng)物免疫34-35
• 2、細(xì)胞培養(yǎng)35
• 3、細(xì)胞融合35-37
• 4、產(chǎn)生抗體的類型37
• 5、抗體生產(chǎn)37-38
• 6、抗體純化38-39
• 第五章 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 綜述44-54
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 附錄一：縮略詞對照表54-55
• 附錄二：碩士在讀期間學(xué)術(shù)成果55-56
• 致謝56-57

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1 段薇,張健,鄭劍玲,蘇丹,王美慧;抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體的研制[J];微生物學(xué)雜志;2004年05期

2 張唯敏;;新單克隆抗體已應(yīng)用于臨床[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);1986年04期

3 遲素敏;;單克隆抗體的制備和鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1986年Z1期

4 張明杰;單克隆抗體在農(nóng)業(yè)中有何用途?[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1991年02期

5 孫國鳳;;單克隆抗體藥品在日本通過調(diào)查會(huì)[J];生物技術(shù)通報(bào);1991年09期

6 ;一種制備單克隆抗體的更有效而經(jīng)濟(jì)的方法[J];國外醫(yī)學(xué)(臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊);1998年05期

7 任新玲,沈麗英,金伯泉,井曉梅,王睿;表皮生長因子受體單克隆抗體抗肺癌作用的研究[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年03期

8 章波,陳惠鵬,范國才,陳吉中,王清明;抗人肝再生增強(qiáng)因子單克隆抗體的研制[J];免疫學(xué)雜志;2000年06期

9 李鳳英,陳名道,顧衛(wèi)瓊,陳春榮,唐金鳳;人瘦素單克隆抗體的鑒定[J];放射免疫學(xué)雜志;2000年02期

10 陳志南,蔣建利;單克隆抗體——從鼠到人[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2000年03期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐爽;安萬新;胡榮花;葉萍;孟祥昱;;不同方法收集單克隆抗體濃縮后的比較[A];中國輸血1999年年會(huì)暨紀(jì)念A(yù)BO血型發(fā)現(xiàn)100周年學(xué)術(shù)交流論文專輯[C];1999年

2 劉大維;高斌;;狂犬病毒單克隆抗體的研制[A];2010年中國科學(xué)院微生物研究所博士后學(xué)術(shù)年會(huì)暨第二屆博誼論壇論文摘要集[C];2011年

3 陳炅;;治療性單克隆抗體的作用靶點(diǎn)及臨床應(yīng)用[A];2013年中國臨床藥學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)暨第九屆臨床藥師論壇論文集[C];2013年

4 徐爽;徐焱;;單克隆抗體在輸血領(lǐng)域的應(yīng)用探討[A];中國輸血1999年年會(huì)暨紀(jì)念A(yù)BO血型發(fā)現(xiàn)100周年學(xué)術(shù)交流論文專輯[C];1999年

5 彭虹;舒翠麗;劉永全;王華;高杰英;;抗人α4單克隆抗體的制備和鑒定[A];中國免疫學(xué)會(huì)第四屆學(xué)術(shù)大會(huì)會(huì)議議程及論文摘要集[C];2002年

6 祭芳;史建榮;陳正賢;徐劍宏;陸瓊嫻;;抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體的制備[A];中國植物病理學(xué)會(huì)2008年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2008年

7 張光波;董秋明;於葛華;李文香;張學(xué)光;;一株鼠抗人4-1BB單克隆抗體的研制及其生物學(xué)功能的鑒定[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

8 張錦超;楊金菊;吳瓊;李戩;陳勇;李輝;宋穎博;羅曉彤;任飛;高媛;杜雪梅;鞠艷芳;王兆卿;王京蘭;徐菡;柳曉蘭;崔玉芳;錢小紅;賀福初;高建恩;孫啟鴻;;高效鑒定單克隆抗體所識別未知抗原技術(shù)平臺的建立及應(yīng)用[A];中國蛋白質(zhì)組學(xué)第二屆學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要論文集[C];2004年

9 楊永昌;王北寧;賴春寧;黎燕;;抗血小板單克隆抗體重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)[A];第五次全國中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

10 孫效;高新;尚明美;宋海峰;湯仲明;;抗胰高血糖素樣肽單克隆抗體的制備[A];第八次全國藥物與化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 尹暉;單克隆抗體研發(fā)進(jìn)入新階段[N];無錫日報(bào);2010年

2 編譯 李勇;單克隆抗體：生物類似藥開發(fā)的秘鑰[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2014年

3 廣凱;單克隆抗體藥物將有大發(fā)展[N];中國醫(yī)藥報(bào);2000年

4 ;單克隆抗體應(yīng)用前景看好[N];中國醫(yī)藥報(bào);2002年

5 黃東臨;羅氏叱咤單克隆抗體市場[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2005年

6 ;單克隆抗體異軍突起[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2003年

7 尹暉;全球最大單克隆抗體研制基地落戶無錫[N];中國醫(yī)藥報(bào);2010年

8 尹暉;最大單克隆抗體研制項(xiàng)目在馬山奠基[N];無錫日報(bào);2010年

9 數(shù)文;羅氏買進(jìn)抗癌單克隆抗體[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

10 毛文波;單克隆抗體：征服癌癥的新方法[N];科技日報(bào);2004年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 魏德強(qiáng);以植物病毒為載體建立新型的載體—半抗原免疫體系[D];東北林業(yè)大學(xué);2014年

2 王璞;以CD146為靶點(diǎn)的胃癌早期診斷多功能納米探針的相關(guān)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 張瀟;抗EV71病毒單克隆抗體及柯薩奇病毒病毒樣顆粒的制備研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2015年

4 鄒年莉;雞傳染性支氣管炎病毒Sczy3 S1蛋白中和性單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 程林;人△42PD1特異性單克隆抗體的制備及其免疫功能的初步探討[D];南京大學(xué);2014年

6 王海;直腸癌上調(diào)表達(dá)蛋白eEF2單克隆抗體制備及臨床應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2016年

7 孫佳善;禽流感、新城疫和犬瘟熱病毒單克隆抗體篩選策略比較及應(yīng)用研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 胡新韜;HIV-1B'和CRF07_BC慢性感染者中和抗體應(yīng)答特征及CD4bs抗原特異性單克隆抗體分離鑒定初步研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2012年

9 白宇;馬γ-干擾素單克隆抗體的制備及細(xì)胞免疫評價(jià)方法的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

10 余自強(qiáng);抗血小板膠原受體糖蛋白VI單克隆抗體的制備和功能研究[D];蘇州大學(xué);2005年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王曉磊;流行性乙型腦炎病毒單克隆抗體的制備與prM-E蛋白抗原捕獲ELISA檢測方法的建立[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 葛新杰;NT-proBNP單克隆抗體的研制及ELISA定量檢測方法的建立[D];鄭州大學(xué);2015年

3 張標(biāo);鼠抗人B7-H4受體單克隆抗體的研制及其生物學(xué)功能的初步研究[D];蘇州大學(xué);2015年

4 鄭瑩;CD123在兒童B系急性淋巴細(xì)胞性白血病中的表達(dá)與抗人CD123單克隆抗體的制備[D];蘇州大學(xué);2015年

5 董倩;JEV NS2B蛋白單克隆抗體的制備及其應(yīng)用[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 薛翼鵬;豬CR1-like單克隆抗體的制備及CR1-like在豬紅細(xì)胞膜表面分布狀態(tài)的研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 繆歡;JEV PrM/M蛋白單克隆抗體的制備及JEV P3感染U251細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 仲曉麗;犬副流感病毒單克隆抗體的制備及單鏈抗體蛋白的表達(dá)和活性鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 劉靜靜;綿羊早孕因子單克隆抗體的制備及鑒定[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 安蓮;B型流感嗜血桿菌寡糖綴合物疫苗的免疫活性研究相關(guān)單克隆抗體的制備[D];山東大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：抗人胱抑素C單克隆抗體的制備及初步鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：426986