本文關(guān)鍵詞：衰老引起腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷的機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的血液流動(dòng)產(chǎn)生的剪切力作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,從而調(diào)節(jié)血管張力和直徑。內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)剪切力誘導(dǎo)產(chǎn)生一些血管舒張因子使血管平滑肌擴(kuò)張是影響血管直徑擴(kuò)張的主要因素。瞬時(shí)感受器電位通道(TRP)家族香草素受體亞家族(TRP vanilloid subtype 4,TRPV4)參與了這一過(guò)程,它是鈣通透的非選擇陽(yáng)離子通道,介導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加。本研究中,利用血管直徑檢測(cè)系統(tǒng)比較年輕大鼠與老年大鼠腸系膜上動(dòng)脈剪切力以及TPPV4通道激動(dòng)劑4α-PDD誘導(dǎo)的血管舒張程度。利用鈣成像技術(shù)檢測(cè)原代培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞(mesenteric artery endothelial cells,MAECs)剪切力以及4α-PDD誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。采用蛋白免疫印跡以及免疫熒光染色法比較老年大鼠與年輕大鼠腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的TRPV4蛋白含量表達(dá)水平。方法1.動(dòng)物分組雄性清潔級(jí)成年Sprague-Dawley大鼠,分為兩組:年輕大鼠3~4月齡,老年大鼠20~22月齡。2.原代培養(yǎng)腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞將分離出的腸系膜上動(dòng)脈置于10 m L含0.02%的膠原蛋白酶PBS(phosphate-buffered saline)液中,置于37oC恒溫水浴振蕩器中蕩分離出內(nèi)皮細(xì)胞,種于培養(yǎng)皿,放入CO2溫箱中培養(yǎng)3-5天,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.鈣離子成像用鈣離子熒光指示劑Fluo-8和普流羅尼類F-127孵育細(xì)胞30min。熒光比率(F1/F0)表示細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。萊卡TCS SP5共聚焦系統(tǒng)記錄并分析熒光信號(hào)。以毒胡蘿卜素誘導(dǎo)鈣庫(kù)釋放后,加入TRPV4通道蛋白抑制劑RN1734,再加入鈣離子,觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化;改變?cè)〔蹆蓚?cè)壓力,觀察老年組和年輕組腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞剪切力誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化情況。4.檢測(cè)腸系膜上動(dòng)脈血管直徑變化將分離好的腸系膜上動(dòng)脈血管段固定于血管直徑檢測(cè)系統(tǒng)(Danish Myo Technology,Denmark,model 110P)中,觀察老年大鼠和年輕大鼠腸系膜上動(dòng)脈剪切力誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管舒張的變化;使用TRPV4通道抑制劑RN1734,阻斷TRPV4通道,觀察腸系膜上動(dòng)脈剪切力誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張的變化;使用TRPV4通道激動(dòng)劑4α-PDD,觀察老年大鼠和年輕大鼠腸系膜上動(dòng)脈剪切力誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴性血管舒張的變化。5.蛋白免疫印跡和免疫熒光染色:使用anti-TRPV4抗體,分別檢測(cè)老年大鼠和年輕大鼠腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞TRPV4蛋白表達(dá)的水平。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(`x±SE)表示,組間樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.剪切力誘導(dǎo)引起大鼠腸系膜上動(dòng)脈剪切力引起的血管舒張反應(yīng)與內(nèi)皮細(xì)胞鈣濃度的變化。與年輕組相比,老年組腸系膜上動(dòng)脈剪切力誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)和原代培養(yǎng)的腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞剪切力誘導(dǎo)Ca2+濃度升高的效應(yīng)明顯減弱;2.4α-PDD誘導(dǎo)的血管舒張以及其引起的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化與年輕大鼠相比,老年大鼠TRPV4通道蛋白激動(dòng)劑4α-PDD誘導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)明顯減弱;與年輕組相比,加入TRPV4通道蛋白激動(dòng)劑4α-PDD誘導(dǎo)的腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度升高明顯減弱;3.驗(yàn)證TRPV4在剪切力誘導(dǎo)的腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞鈣濃度增加和血管舒張的作用。TRPV4通道蛋白抑制劑RN1734顯著抑制剪切力誘導(dǎo)的腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高和血管舒張反應(yīng);4.蛋白免疫印跡與免疫熒光染色與年輕大鼠相比,老年大鼠腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中TRPV4蛋白表達(dá)水平均顯著降低。結(jié)論TRPV4參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮依賴性剪切力誘導(dǎo)的鈣離子濃度升高與血管舒張,,TRPV4蛋白水平表達(dá)降低與其介導(dǎo)的鈣信號(hào)減弱可能參與了衰老引起的大鼠腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮功能損傷。目的內(nèi)皮功能障礙是導(dǎo)致心血管疾病的主要原因,并且引起心血管系統(tǒng)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能的改變[1,2,3]。老化會(huì)導(dǎo)致相關(guān)的血管內(nèi)皮以及平滑肌功能障礙[2]。同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞間傳導(dǎo)通路與交流也發(fā)生改變[2]。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能主要由幾種因子的調(diào)節(jié),包括內(nèi)皮依賴性舒張因子(EDRF),內(nèi)皮依賴性收縮因子(EDCF),內(nèi)皮依賴性超極化因子(EDHF)[3,4,5]。老化過(guò)程伴隨著血管內(nèi)皮產(chǎn)生的血管舒張物質(zhì)和血管收縮物質(zhì)之間的平衡減弱。這一失衡可能會(huì)引起一氧化氮生物利用率下降以及環(huán)氧合酶產(chǎn)生的收縮因子減少[3,4,5]。這些現(xiàn)象與衰老過(guò)程中的促炎性細(xì)胞因子表達(dá)升高有關(guān),也影響相關(guān)酶的活性和表達(dá)[6,7]。鈣庫(kù)操縱鈣離子內(nèi)流(SOCE)是血管內(nèi)皮細(xì)胞中調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流的主要機(jī)制[8,9],細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)的清空導(dǎo)致細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流[8]。SOCE補(bǔ)償了細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù),更重要的是調(diào)節(jié)了各種細(xì)胞反應(yīng)[8]。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,SOCE參與調(diào)節(jié)血管張力,血管通透性,以及其他功能[10,11]。但鈣庫(kù)操縱鈣離子內(nèi)流(SOCE)作為內(nèi)皮細(xì)胞鈣平衡的重要調(diào)節(jié)機(jī)制[12]在衰老引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙中的作用卻未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)探討衰老對(duì)腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(MAECs)SOCE影響及其介導(dǎo)的血管舒張功能的影響。方法1.動(dòng)物分組雄性成年SD大鼠,分為兩組:年輕大鼠3~4月齡,老年大鼠20~22月齡。2.原代培養(yǎng)腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞將分離出的腸系膜上動(dòng)脈置于10 m L含0.02%的膠原蛋白酶的PBS(phosphate-buffered saline)液中,置于37℃恒溫水浴振蕩器中振蕩30 min出內(nèi)皮細(xì)胞,種于培養(yǎng)皿,放入CO2溫箱中培養(yǎng)3-5天,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.鈣離子成像用鈣離子熒光指示劑Fluo-8和普流羅尼類F-127孵育30 min。熒光比率(F1/F0)表示細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。萊卡TCS SP5共聚焦系統(tǒng)記錄并分析熒光信號(hào)。以毒胡蘿卜素和緩激肽誘導(dǎo)鈣庫(kù)釋放后,加入鈣離子,觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。4.檢測(cè)腸系膜上動(dòng)脈血管直徑變化將分離好的腸系膜上動(dòng)脈血管段固定于血管直徑檢測(cè)系統(tǒng)(Danish Myo Technology,Denmark,model 110P)中,比較老年和年輕大鼠緩激肽(BK)引起腸系膜上動(dòng)脈血管舒張反應(yīng)5.免疫熒光染色免疫熒光染色技術(shù)比較Orai 1和基質(zhì)相互作用因子(STIM 1)在老年和年輕大鼠腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)情況。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(`x±SE)表示,組間樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.與年輕大鼠相比,緩激肽引起的老年大鼠腸系膜上動(dòng)脈血管舒張功能減弱了;2.在原代培養(yǎng)的腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,毒胡蘿卜素與緩激肽誘導(dǎo)的SOCE分別減弱;3.SOCE的組成成分Orai 1和STIM 1表達(dá)明顯減少。結(jié)論衰老引起大鼠腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的SOCE及其介導(dǎo)的血管舒張功能顯著減弱,SOC通道組成蛋白Orai 1與STIM 1蛋白表達(dá)水平降低可能參與這一改變。
【關(guān)鍵詞】：TRPV4 內(nèi)皮細(xì)胞 剪切力 腸系膜上動(dòng)脈 血管舒張 腸系膜上動(dòng)脈 內(nèi)皮細(xì)胞 鈣庫(kù)操縱鈣內(nèi)流 基質(zhì)相互作用因子1 Orai1 PartⅡ
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R339.38
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表5-6
• 第一部分：TRPV4參與衰老引起的大鼠腸系膜上動(dòng)脈剪切力誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能損傷6-32
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-20
• 結(jié)果20-27
• 討論27-28
• 結(jié)論28-29
• 參考文獻(xiàn)29-32
• 第二部分：衰老引起的腸系膜上動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞鈣庫(kù)操縱鈣內(nèi)流減弱的研究32-51
• 中文摘要32-34
• 英文摘要34-37
• 前言37-38
• 材料與方法38-41
• 結(jié)果41-47
• 討論47-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-51
• 附錄51-53
• 致謝53-54
• 綜述54-68
• 參考文獻(xiàn)63-68

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3 張偉;北京大學(xué)第三醫(yī)院 應(yīng)用新方法成功救治復(fù)雜腸系膜上動(dòng)脈閉塞患者[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2009年

4 時(shí)仲省;鄭大一附院治療罕見(jiàn)假性腸系膜上動(dòng)脈瘤成功[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2009年

5 高國(guó)起;采用旁路手術(shù)治療腸系膜上動(dòng)脈閉塞獲成功[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2009年

6 時(shí)仲省;腹痛原是血栓“暗渡陳倉(cāng)”[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2008年

7 任孟軍;多年診治無(wú)結(jié)果 追問(wèn)病史可澄清[N];農(nóng)村醫(yī)藥報(bào)（漢）;2007年

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本文編號(hào)：419005