本文關(guān)鍵詞：剛地弓形蟲Prx體外抗氧化機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:原核表達剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)過氧化物氧化還原酶(peroxiredoxin,Prx)的基因,并制備多克隆抗體。使弓形蟲Prx基因在Hep G2細胞過表達,不同終濃度H2O2誘導細胞凋亡,通過測定細胞的ROS生成量的變化來探討Prx在細胞抗氧化中所起的作用以及作用機制。方法:構(gòu)建原核表達載體Prx/p ET-28a(+)使之在大腸埃希氏菌(E.coil)Rosetta株中表達,通過對重組蛋白誘導表達時間、濃度和溫度的優(yōu)化及純化,用純化后的重組蛋白免疫家兔得到多克隆抗體,用Wesstern blotting的方法鑒定多克隆抗體的特異性。構(gòu)建真核表達載體Prx/p3XFLAG-Myc-CMVTM-24使之在Hep G2細胞中表達,通過大量提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒,利用非脂質(zhì)陽離子聚合物Ronfect TM試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Hep G2細胞中,在24 h、48 h和72 h收集轉(zhuǎn)染的細胞,用抗Prx多克隆抗體通過Wenstern blotting的方法檢測Prx基因在Hep G2細胞的表達。24孔板接種培養(yǎng)Hep G2細胞24 h后,分別轉(zhuǎn)染空載p3XFLAG-Myc-CMVTM-24質(zhì)粒(空載轉(zhuǎn)染組)和真核表達重組質(zhì)粒Prx/p3XFLAG-Myc-CMVTM-24(轉(zhuǎn)染組),收集細胞前24 h加入終濃度為200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L和1 600μmol/L的H2O2誘導細胞凋亡。于轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞,對細胞懸液用Annexin V-FITC/PI染色,利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。用DCFH-DA染色,利用流式細胞術(shù)檢測細胞活性氧的生成量。結(jié)果:原核表達獲取的多克隆抗體經(jīng)過Wenstern blotting方法鑒定證明有很好的特異性,可用于后續(xù)試驗。轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h的Hep G2細胞,用Wenstern blotting方法在25 KDa處檢測到有特異性行條帶出現(xiàn),與Prx理論大小相符,且Prx在48 h表達量最高。轉(zhuǎn)染后48 h,H2O2終濃度為200μmol/L、400μmol/L和800μmol/L轉(zhuǎn)染組的凋亡率均低于轉(zhuǎn)染空載組的凋亡率,兩組差別有統(tǒng)計學意義(P0.05),終濃度為1 600μmol/L的轉(zhuǎn)染組的凋亡率和轉(zhuǎn)染空載組的凋亡率無明顯差別。轉(zhuǎn)染后48 h,H2O2終濃度為200μmol/L、400μmol/L和800μmol/L的轉(zhuǎn)染組的ROS的生成量低于空載組ROS的生成量,兩組差別有統(tǒng)計學意義(P0.05),終濃度為1 600μmol/L的轉(zhuǎn)染組的ROS生成量和空載組的ROS生成量無明顯差別。結(jié)論:成功構(gòu)建原核表達載體Prx/p ET-28a(+)并在Rosetta中大量表達,得到純化后的重組蛋白,免疫家兔獲得多克隆抗體,Wenstern blotting技術(shù)鑒定多克隆抗體有很好的特異性。成功構(gòu)建真核表達載體,Prx蛋白在Hep G2細胞過表達,且轉(zhuǎn)染后48 h表達量最高。弓形蟲Prx具有抗氧化作用,其作用機制是,通過消除細胞內(nèi)的ROS,從而減少氧化應激對蟲體的損害,達到抗氧化的目的。
【關(guān)鍵詞】：剛地弓形蟲 過氧化物氧化還原酶 HepG2 細胞凋亡 ROS
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R382.5
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 主要縮略詞表9-14
• 第一章 緒論14-18
• 1.1 弓形蟲的致病機制14-15
• 1.2 Prx的研究現(xiàn)狀15-16
• 1.3 細胞凋亡的機制和誘導因素16
• 1.4 弓形蟲感染抑制細胞凋亡16-17
• 1.5 本研究的意義17-18
• 第二章 弓形蟲PRX基因的原核表達及鑒定18-36
• 2.1 實驗儀器和材料18-22
• 2.1.1 實驗儀器18-19
• 2.1.2 實驗材料19
• 2.1.3 實驗試劑19-20
• 2.1.4 相關(guān)試劑的配制20-22
• 2.1.5 菌株和載體22
• 2.1.6 細胞和蟲體22
• 2.2 實驗方法22-30
• 2.2.1 He La細胞系的傳代培養(yǎng)和蟲體的傳代培養(yǎng)22
• 2.2.2 弓形蟲Prx基因的擴增22-24
• 2.2.3 重組載體Prx/p TG19-T的構(gòu)建和鑒定24-26
• 2.2.4 重組表達載體Prx/p ET-28a（+）的構(gòu)建與鑒定26-28
• 2.2.5 重組蛋白的誘導表達和可溶性分析28
• 2.2.6 重組蛋白的純化28-29
• 2.2.7 兔多克隆抗體的制備和鑒定29-30
• 2.3 結(jié)果30-34
• 2.3.1 弓形蟲Prx基因擴增結(jié)果30-31
• 2.3.2 重組Prx/p TG19-T質(zhì)粒的鑒定31
• 2.3.3 重組質(zhì)粒Prx/p ET-28a（+）的雙酶切鑒定31-32
• 2.3.4 重組蛋白的誘導表達32-33
• 2.3.5 重組蛋白的純化33
• 2.3.6 多克隆抗體的鑒定33-34
• 2.4 討論34-36
• 第三章 弓形蟲P3×FLAG-MYC-CMVTM24PRX在HEPG2細胞中表達36-46
• 3.1 實驗材料和儀器36-37
• 3.1.1 實驗材料36
• 3.1.2 實驗試劑36
• 3.1.3 實驗儀器36
• 3.1.4 細胞株和菌株36-37
• 3.1.5 相關(guān)試劑的配制37
• 3.2 實驗方法37-42
• 3.2.1 弓形蟲Prx基因的擴增37
• 3.2.2 重組載體Prx/p TG19-T的構(gòu)建與鑒定37-38
• 3.2.3 重組表達載體Prx/p3×FLAG-Myc-CMVTM-24 的構(gòu)建與鑒定38-39
• 3.2.4 真核表達質(zhì)粒Prx/p3×FLAG-Myc-CMVTM-24 的大量提取39-40
• 3.2.5 Hep G2細胞的復蘇和傳代40-41
• 3.2.6 p3×FLAG-Myc-CMVTM24Prx轉(zhuǎn)染Hep G2細胞41-42
• 3.2.7 Western blotting技術(shù)檢測Prx的表達42
• 3.3 結(jié)果42-44
• 3.3.1 弓形蟲Prx基因擴增結(jié)果42-43
• 3.3.2 重組載體Prx/p TG19-T的單酶切鑒定結(jié)果43
• 3.3.3 重組真核表達質(zhì)粒Prx/p3×FLAG-Myc-CMVTM-24 的雙酶切鑒定43-44
• 3.3.4 Western blotting技術(shù)檢測Prx在Hep G2細胞中的表達44
• 3.4 討論44-46
• 第四章 弓形蟲PRX體外抗氧化研究46-56
• 4.1 實驗儀器和材料46-47
• 4.1.1 實驗儀器46-47
• 4.1.2 實驗材料47
• 4.1.3 實驗試劑47
• 4.1.4 試劑配制47
• 4.1.5 細胞47
• 4.2 實驗方法47-49
• 4.2.1 Hep G2細胞的復蘇和傳代47
• 4.2.2 Hep G2細胞的轉(zhuǎn)染與凋亡誘導47-48
• 4.2.3 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡48-49
• 4.2.4 細胞ROS檢測49
• 4.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計49
• 4.3 實驗結(jié)果49-52
• 4.3.1 Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡率的結(jié)果49
• 4.3.2 細胞ROS檢測的結(jié)果49-52
• 4.4 討論52-56
• 結(jié)論與展望56-58
• 參考文獻58-66
• 致謝66-68
• 在學期間發(fā)表的學術(shù)論文及參加課題：68-69

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本文編號：416468