本文關(guān)鍵詞：磁性人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板的研制及抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和反應(yīng)活性的檢測(cè)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：抗原特異性T淋巴細(xì)胞(Antigen-Specific T cell, AST)是介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞,在抗感染、抗腫瘤、超敏反應(yīng)、自身免疫病以及移植排斥中都起著至關(guān)重要的作用,其數(shù)量的多寡和功能的強(qiáng)弱能直接反映人體特異性細(xì)胞免疫的功能狀態(tài)。但是,與特異性抗體的檢測(cè)相比,抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量和功能檢測(cè)都困難許多,方法少而復(fù)雜。目前pMHC多聚體熒光染色加流式細(xì)胞分析技術(shù)是抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于多聚體制備技術(shù)復(fù)雜,商品化產(chǎn)品種類少,且昂貴,不呈系列,限制了其廣泛應(yīng)用。針對(duì)抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和功能的檢測(cè),無(wú)論是普遍應(yīng)用的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法,還是pMHC多聚體流式染色法以及新近出現(xiàn)的pMHC芯片法和人工抗原提呈細(xì)胞芯片技術(shù)等,各有其優(yōu)勢(shì)和缺陷,每種方法單獨(dú)應(yīng)用于T細(xì)胞的檢測(cè)都不能簡(jiǎn)單快速地同步進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量和功能的分析。因此創(chuàng)建一種簡(jiǎn)單易行、可同步對(duì)抗原特異性T細(xì)胞進(jìn)行數(shù)量和反應(yīng)活性檢測(cè)的新方法成為一個(gè)新的探索方向。為此,本研究利用商品化的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體作為靶向抗原,包被在直徑4.5微米的磁珠表面制成磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞(aAPC-beads),以O(shè)T-1轉(zhuǎn)基因鼠脾淋巴細(xì)胞群中的OVA抗原特異性T細(xì)胞作為待檢的靶細(xì)胞,建立了磁性人工抗原提呈細(xì)胞微孔反應(yīng)板技術(shù)(aAPC-microplate),優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)方案,并著重進(jìn)行了方法學(xué)論證。該技術(shù)的基本方案是：將aAPC-beads與OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞以1：1的比例接種在已包被有抗IFN-γ抗體的透明酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)微孔板(ELISPOT板)中共孵育2小時(shí),然后在96孔板式磁場(chǎng)的作用下分選與磁珠結(jié)合的OVA抗原特異性T細(xì)胞,光鏡下計(jì)數(shù)分選所得細(xì)胞數(shù),計(jì)算其占接種的淋巴細(xì)胞數(shù)的比例；繼而在分選孔中加入抗原性刺激物,置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),激發(fā)OVA抗原特異性T細(xì)胞活化并分泌細(xì)胞因子,最后用ELSIPOT技術(shù)檢測(cè)分泌IFN-γ的細(xì)胞,計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù),計(jì)算分選所得細(xì)胞群中有反應(yīng)活性的細(xì)胞比例。另外,由于商業(yè)化二聚體H-2Kb-Ig/dimer價(jià)格昂貴,且我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)必須用自制的多聚體進(jìn)行方法學(xué)論證,故我們用OVA257-264抗原肽、β2m、H-2Kbα鏈胞外區(qū)以及Avi標(biāo)簽和His6標(biāo)簽重組成單鏈融合基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒,進(jìn)而進(jìn)行表達(dá)、提取和純化制備SCT復(fù)合物。本論文的主要結(jié)果如下：1、aAPC-microplate優(yōu)化方案(CD8-T細(xì)胞預(yù)分選)檢測(cè)OVA抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量時(shí),每個(gè)待檢細(xì)胞樣品設(shè)5.個(gè)檢測(cè)數(shù)量組,海個(gè)細(xì)胞數(shù)量組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,.每個(gè)數(shù)量組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)由復(fù)孔的平均值表示,最終的陽(yáng)性細(xì)胞比例由5個(gè)檢測(cè)數(shù)量組的直線回歸方程校正得出。方法學(xué)的準(zhǔn)確性分析顯示：磁珠分選所得細(xì)胞數(shù)與接種的淋巴細(xì)胞數(shù)之間呈現(xiàn)了良好的數(shù)量依賴關(guān)系和線性關(guān)系,R2值達(dá)到0.99以上。5只OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群中OVA抗原特異性T細(xì)胞的比例分別為11.27%、9：40%、12.62%、14.77%和21.85%；經(jīng)典的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體熒光染色及流式分析結(jié)果分別為13.69%、10.13%、16.88%、16.77%和21.45%。兩組數(shù)據(jù)問(wèn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,相關(guān)系數(shù)為0：9280；PE-anti-mouse TCR Vα2熒光染色及流式分析結(jié)果分別為15.94%、18.23%、32.08%、31.29%和42.88%,明顯高于H-2Kb-Ig/OVA257-264 二聚體熒光染色結(jié)果和aAPC-microplate檢測(cè)法結(jié)果,差異顯著(p0.05),相關(guān)系數(shù)分別為0.85-0和-8054。特異性分析顯示：用無(wú)關(guān)抗原肽的Kb/TRP2-beads同步分選OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群時(shí),陽(yáng)性細(xì)胞比例則降為0.45%左右；經(jīng)Kb/OVA-beads磁珠分選后所得細(xì)胞群中的OVA抗原特異性T細(xì)胞比例經(jīng)H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體熒光染色及流式分析為84.48%和89.80%(兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果),而分選前的比例為13.69%和10.13%。重復(fù)性分析顯示：在5個(gè)檢測(cè)數(shù)量組之間,陽(yáng)性細(xì)胞比例的平均批內(nèi)CV值為4.4%；對(duì)同一份OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí),批間CV值為13.5%,陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為9.40%、9.77%和9.47%；R2值分別為0.9959、0.9970和0.9960。上述結(jié)果顯示aAPC-microplate優(yōu)化方案具有較高韻特異性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性以及與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的相關(guān)性,提示了該技術(shù)檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量的可行性。2、aAPC-microplate優(yōu)化方案同步檢測(cè)OVA抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量和反應(yīng)活性時(shí),經(jīng)過(guò)磁珠分選和計(jì)數(shù)后,兩只OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞群中OVA特異性T細(xì)胞比例為12.62%和21.85%,與經(jīng)典的pMHC二聚體熒光染色法的結(jié)果(16.88%和21.45%)相近。在3種不同形式和性質(zhì)的刺激物中,PHA刺激OVA抗原特異性T細(xì)胞活化并分泌IFN-y的能力最強(qiáng),反應(yīng)活性比達(dá)59.91-63.99%；其它兩種刺激劑(磁珠式aAPC-beads,游離的OVA多肽+anti-CD28)的刺激能力次之,反應(yīng)活性比在45.14-54.35%,且相互間差異不顯著。這提示了aAPC-microplate技術(shù)在評(píng)價(jià)抗原特異性T細(xì)胞活性功能方面的可行性。3、通過(guò)PCR技術(shù)將兩個(gè)寡核苷酸接頭(Linker)與OVA257-264抗原肽、β2m、H-2Kbα鏈胞外區(qū)以及Avi標(biāo)簽和His6標(biāo)簽重組成單鏈融合基因,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒,在BL21菌中表達(dá)、提取和純化了H-2Kb/OVA單鏈三聚體包涵體蛋白(SCT),并在體外通過(guò)稀釋復(fù)性法折疊成H-2Kb/OVA SCT復(fù)合單體,通過(guò)生物素-親和素系統(tǒng)制備了PE標(biāo)記的H-2Kb/OVA SCT四聚體。將H-2Kb/OVA SCT復(fù)合單體包被細(xì)胞大小的磁珠后用H-2Kb分子構(gòu)象特異性單抗進(jìn)行熒光染色和流式分析,驗(yàn)證了折疊后的H-2Kb/OVA SCT復(fù)合單體在磁珠表面具有正確的空間構(gòu)象和定向；利用PE-H-2Kb/OVA SCT四聚體對(duì)OT-1鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行熒光染色和流式分析,檢測(cè)OVA抗原特異性T細(xì)胞的比例(19.90%),并與商品化的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體熒光染色結(jié)果(21.85%)相比較,初步驗(yàn)證了H-2Kb/OVA SCT復(fù)合體與特異性TCR的結(jié)合能力。這些結(jié)果為下一步利用自制pMHC多聚體對(duì)aAPC-microplate技術(shù)重新進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：抗原特異性T細(xì)胞 磁珠式人工抗原提呈細(xì)胞 ELISPOT
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 主要英文縮寫(xiě)詞10-12
• 前言12-16
• 文獻(xiàn)綜述16-29
• 參考文獻(xiàn)25-29
• 第一節(jié) OT-1鼠脾細(xì)胞中OVA抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)29-61
• 引言29-31
• 1. 材料和試劑31-32
• 2. 方法32-37
• 3. 結(jié)果37-59
• 4. 討論59-61
• 第二節(jié) OT-1鼠脾細(xì)胞群中OVA抗原特異性T細(xì)胞數(shù)量和功能的同步檢測(cè)61-83
• 引言61-62
• 1. 材料和試劑62-63
• 2. 方法63-67
• 3. 結(jié)果67-82
• 4. 討論82-83
• 第三節(jié) H-2Kb/OVA SCT重組質(zhì)粒的構(gòu)建及SCT蛋白構(gòu)象與功能的驗(yàn)證83-100
• 引言83-84
• 1. 材料和試劑84-86
• 2. 方法86-94
• 3. 結(jié)果94-98
• 4. 討論98-100
• 小結(jié)與展望100-101
• 參考文獻(xiàn)101-105
• 致謝105-106
• 作者簡(jiǎn)介106-107
• 附件107

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 高美華;李園園;王麗娜;叢蓓蓓;王冰;張蓓;李營(yíng);梁潔;;CD59促進(jìn)LAT介導(dǎo)的T細(xì)胞活化[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2014年07期

2 鮑軼;郭麗;;γδT細(xì)胞表達(dá)共刺激分子及協(xié)同信號(hào)通路的研究進(jìn)展[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2014年02期

3 李慧忠;暢繼武;;可溶性MHC-肽四聚體技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展[J];現(xiàn)代免疫學(xué);2007年01期

4 虞偉;武建國(guó);;ELIspot技術(shù)及其在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2006年06期

5 姚朗;細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)活性測(cè)定方法進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè);2002年02期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 余鳴鳴;InsB15-23 H-2K~d單鏈三聚體在NOD小鼠體內(nèi)誘生特異性CD8~+T細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2012年

2 趙艷霞;新型PR1-HLA-A~*0201-SCT四聚體的制備及初步鑒定[D];揚(yáng)州大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：416398