發(fā)布時(shí)間：2017-06-02 17:01

  本文關(guān)鍵詞：鼠疫耶爾森氏菌降解其分泌的鼠毒素研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌(以下簡(jiǎn)稱鼠疫菌)引起的一種自然疫源性烈性傳染病,歷史上曾發(fā)生過(guò)三次人間鼠疫大流行引起數(shù)以億計(jì)的人死亡,給人類帶來(lái)巨大的災(zāi)難。鼠疫在我國(guó)被規(guī)定為甲類傳染病,我國(guó)鼠疫自然疫源地分布廣泛,占國(guó)土面積的15%左右,且疫區(qū)動(dòng)物鼠疫流行面積不斷擴(kuò)大,人間鼠疫病例呈上升態(tài)勢(shì)。此外,鼠疫菌又是一種生物戰(zhàn)劑和恐怖劑,威脅著人類的安全。因此鼠疫的防治對(duì)人民健康安全、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定依然具有重要意義。毒力完整的鼠疫菌含有三個(gè)毒力質(zhì)粒(p CD1、p MT1、p PCP1),其中p CD1質(zhì)粒被認(rèn)為是鼠疫菌增殖擴(kuò)散發(fā)揮毒力作用最主要的毒力質(zhì)粒,其編碼的T3SS將Yops蛋白 注射‖到宿主細(xì)胞中,通過(guò)干擾細(xì)胞的正常生理功能、抑制免疫反應(yīng)導(dǎo)致宿主死亡。p MT1質(zhì)粒主要編碼了鼠毒素,是鼠疫菌在跳蚤中腸生存形成菌栓[1]的重要因素,在鼠疫菌傳播中發(fā)揮重要作用。p PCP1質(zhì)粒主要編碼pla基因,Pla蛋白具有蛋白水解酶活性,并且可以降解Yops蛋白,是導(dǎo)致鼠疫菌高侵襲性的重要因素[2,3]。故p MT1、p PCP1質(zhì)粒在鼠疫菌傳播和擴(kuò)散的過(guò)程中也起到了非常重要的作用。在前期工作中,我們使用一株自內(nèi)蒙古分離的布氏田鼠(Microtus brandii)型鼠疫菌201株,它含有p PCP1質(zhì)粒、p CD1質(zhì)粒、p MT1質(zhì)粒和p CRY質(zhì)粒。本室倪斌博士以鼠疫菌201株為母本,采用質(zhì)粒無(wú)痕消除的策略,對(duì)4個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行了不同程度的消除,獲得了不同質(zhì)粒缺失的突變株[4](201-p PCP1+p CD1+p MT1+、201-p PCP1+p MT1+、201-p PCP1+p CD1+、201-p CD1+p MT1+、201-p CD1+、201-p PCP1+、201-p MT1+、201-p)。通過(guò)各質(zhì)粒缺失株小鼠攻毒實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)高劑量下只含有p MT1質(zhì)粒的菌株(201-p MT1+)對(duì)小鼠表現(xiàn)出異常的毒力,這與p MT1質(zhì)粒不含重要的毒力因子的結(jié)論不吻合。通過(guò)對(duì)各質(zhì)粒缺失株進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果顯示所有含p MT1質(zhì)粒的菌株(201-p PCP1+p CD1+p MT1+、201-p PCP1+p MT1+、201-p CD1+p MT1+、201-p MT1+)菌體中均有Ymt條帶,其中含p MT1質(zhì)粒且含p PCP1質(zhì)粒的菌株(201-p PCP1+p CD1+p MT1+、201-p PCP1+p MT1+)的培養(yǎng)上清中檢測(cè)不到Y(jié)mt條帶,但可以檢測(cè)到Y(jié)mt的降解片段;含p MT1質(zhì)粒且不含p PCP1質(zhì)粒的菌株(201-p CD1+p MT1+、201-p MT1+)的培養(yǎng)上清中可以檢測(cè)到Y(jié)mt條帶。一直以來(lái)Ymt被公認(rèn)為是一種胞內(nèi)蛋白,本實(shí)驗(yàn)首次在p PCP1質(zhì)粒缺失株的分泌上清中檢測(cè)到它,提示鼠疫菌分泌的Ymt可能在分泌過(guò)程中被p PCP1質(zhì)粒所降解。為了進(jìn)一步探究Ymt蛋白是否是在分泌過(guò)程中被降解?被哪些基因降解?是否是直接降解?我們利用Red重組系統(tǒng),采用一步法基因突變技術(shù),構(gòu)建了pla敲除株(201-p CD1+-p MT1+-p PCP1+-Δpla、201-p MT1+-p PCP1+-Δpla);利用可以在鼠疫菌內(nèi)復(fù)制,并且拷貝數(shù)與鼠疫菌質(zhì)粒相近的p ACYC184質(zhì)粒,構(gòu)建了pla回補(bǔ)株(201-p CD1+-p MT1+-p PCP1+-Δpla-p ACYC184-pla、201-p MT1+-p PCP1+-Δpla-p ACYC184-pla),基于構(gòu)建成功的pla敲除株和pla回補(bǔ)株,將二者的分泌上清進(jìn)行了SDS-PAGE電泳和WB驗(yàn)證,結(jié)果均顯示敲除了pla的鼠疫菌(201-p CD1+-p MT1+-p PCP1+-Δpla、201-p MT1+-p PCP1+-Δpla)的分泌上清中可以檢測(cè)到Y(jié)mt蛋白,而pla回補(bǔ)株(201-p CD1+-p MT1+-p PCP1+-Δpla-p ACYC184-pla、201-p MT1+-p PCP1+-Δpla-p ACYC184-pla)的分泌上清中檢測(cè)不到Y(jié)mt蛋白,但可以檢測(cè)到Y(jié)mt蛋白的降解片段,證明p PCP1質(zhì)粒編碼的pla降解了Ymt蛋白。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的發(fā)現(xiàn),體外構(gòu)建了BL21-p ET28a-pla、BL21-p ET28a-ymt獲得體外表達(dá)純化的Pla蛋白和Ymt蛋白,并對(duì)純化后的Pla蛋白和Ymt蛋白進(jìn)行了生物活性測(cè)定,證明二者均有活性。其中,重點(diǎn)測(cè)定了Ymt蛋白對(duì)小鼠的毒性,首次觀察了純化Ymt蛋白對(duì)小鼠臟器的病理學(xué)損傷。將純化后的Pla蛋白和Ymt蛋白在離體37℃條件下孵育,孵育后的混合蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果顯示混合蛋白液中只有Ymt蛋白沒(méi)有Ymt蛋白的降解片段,故純化后的Pla不能降解Ymt蛋白。我們將重組質(zhì)粒p ACYC184-pla導(dǎo)入到只含有染色體基因而不含質(zhì)粒的鼠疫菌中構(gòu)建重組菌株(P?-p ACYC184-pla),將重組菌株(P?-p ACYC184-pla)與純化的Ymt蛋白37℃孵育,上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。構(gòu)建重組菌株(E.coli K12-p ACYC184-pla、E.coli K12-p ET28a-pla),重組后的菌株實(shí)驗(yàn)同上。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示兩株重組菌株與Ymt蛋白孵育后的上清中無(wú)Ymt條帶,檢測(cè)到Y(jié)mt降解片段,進(jìn)一步證明在沒(méi)有其他鼠疫菌質(zhì)粒存在的情況下、無(wú)鼠疫菌菌體內(nèi)參與的情況下,Pla蛋白可以降解Ymt蛋白。本研究首次證明Ymt蛋白是分泌蛋白,并且Ymt蛋白在分泌過(guò)程中可以被p PCP1質(zhì)粒編碼的pla所降解。研究過(guò)程中沒(méi)有檢測(cè)到純化后的Pla蛋白降解Ymt蛋白,我們推測(cè)可能是由于Pla降解Ymt還需要借助于其他因子,也可能是Pla蛋白需要特殊的空間結(jié)構(gòu)才發(fā)揮作用,或者Pla降解Ymt蛋白存在一種特殊的機(jī)制。本研究結(jié)果為深入揭示鼠疫菌致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也為鼠疫菌毒力進(jìn)化的研究提供有力證據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：Ymt蛋白 Pla蛋白 鼠疫菌 鼠疫 降解作用
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要8-11
• Abstract11-14
• 縮略詞14-15
• 前言15-21
• 1 鼠疫的爆發(fā)、流行及危害15-16
• 2 鼠疫菌的致病機(jī)制16
• 3 鼠疫菌的毒力因子16-19
• 3.1 鼠疫菌染色體上的毒力因子16-17
• 3.1.1 pgm位點(diǎn)16-17
• 3.1.2 p H6抗原17
• 3.1.3 脂多糖（LPS）17
• 3.1.4 Pho P/Q二元調(diào)控系統(tǒng)17
• 3.2 鼠疫菌質(zhì)粒上的毒力因子17-19
• 3.2.1 p PCP1編碼的毒力因子17-18
• 3.2.2 p MT1編碼的毒力因子18
• 3.2.3 p CD1編碼的毒力因子18-19
• 4 本研究的目的和意義19
• 5 本研究的內(nèi)容19-21
• 第一章 鼠疫菌pla缺失株互補(bǔ)株的構(gòu)建和驗(yàn)證21-31
• 1 引言21-22
• 2 材料與方法22-27
• 2.1 材料22
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒22
• 2.1.2 主要試劑22
• 2.1.3 主要儀器22
• 2.2 方法22-27
• 2.2.1 回補(bǔ)株構(gòu)建22-25
• 2.2.2 回補(bǔ)株驗(yàn)證25-27
• 3 結(jié)果與討論27-30
• 3.1 pla基因回補(bǔ)株的構(gòu)建27-28
• 3.2 蛋白電泳、WB驗(yàn)證回補(bǔ)后pla功能28-30
• 4 結(jié)論30-31
• 第二章 鼠疫菌Pla蛋白的體外表達(dá)純化31-40
• 1 引言31
• 2 材料與方法31-35
• 2.1 材料31-33
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒31
• 2.1.2 主要試劑31-32
• 2.1.3 主要儀器32
• 2.1.4 純化重組蛋白使用溶液的配置32-33
• 2.2 方法33-35
• 2.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建33-34
• 2.2.2 蛋白的表達(dá)34
• 2.2.3 蛋白的變性與復(fù)性34-35
• 2.2.4 Western印跡鑒定目的蛋白35
• 2.2.5 Pla纖溶酶原激活劑的活性測(cè)定35
• 3 結(jié)果與討論35-39
• 3.1 pla基因片段的擴(kuò)增及重組載體的鑒定35-36
• 3.2 Pla蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)36-37
• 3.3 Pla蛋白的變性與復(fù)性37-38
• 3.4 Pla蛋白活性測(cè)定38-39
• 4 結(jié)論39-40
• 第三章 鼠疫菌Ymt蛋白的體外表達(dá)純化40-52
• 1 引言40
• 2 材料與方法40-44
• 2.1 材料40-41
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒40
• 2.1.2 主要試劑40-41
• 2.1.3 主要儀器41
• 2.1.4 蛋白純化試劑41
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物41
• 2.2 方法41-44
• 2.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建41-42
• 2.2.2 蛋白表達(dá)42
• 2.2.3 蛋白的純化42-43
• 2.2.4 Western印跡鑒定目的蛋白43
• 2.2.5 Ymt活性的測(cè)定43-44
• 3 結(jié)果與討論44-50
• 3.1 克隆、誘導(dǎo)表達(dá)Ymt44
• 3.2 Ymt蛋白的純化44-45
• 3.3 重組Ymt蛋白在小鼠體內(nèi)LD50的測(cè)定45-48
• 3.4 Ymt引起小鼠組織病理?yè)p傷48-49
• 3.5 Ymt的 β-腎上腺素能阻斷活性49-50
• 4 討論50-52
• 第四章 鼠疫菌Pla蛋白與Ymt蛋白相互作用52-59
• 1 引言52
• 2 材料與方法52-54
• 2.1 材料52-53
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒52-53
• 2.1.2 主要試劑53
• 2.1.3 主要儀器53
• 2.2 方法53-54
• 2.2.1 pla與ymt直接反應(yīng)53
• 2.2.2 胞內(nèi)表達(dá)重組Pla蛋白與Ymt的相互作用53-54
• 2.2.3 突變失活后的Pla蛋白與Ymt的相互作用54
• 3 結(jié)果與討論54-58
• 3.1 外源提供LPS環(huán)境中Pla蛋白與Ymt蛋白的相互作用54
• 3.2 胞內(nèi)表達(dá)重組Pla蛋白與Ymt的相互作用54-57
• 3.3 突變失活后的Pla蛋白與Ymt的相互作用57-58
• 4 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 附錄63-67
• 主要儀器63-64
• 常用試劑及配制方法64-65
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷65-66
• 在學(xué)期間的研究成果目錄66
• 承擔(dān)課題66-67
• 致謝67-69
• 綜述69-73
• 參考文獻(xiàn)73-74

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