本文關(guān)鍵詞：PA0861在銅綠假單胞菌PAO1中作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的探討銅綠假單胞菌PAO1中GGDEF-EAL結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)PA0861的生物學(xué)功能,并分析環(huán)二鳥苷酸(C-di-GMP)與銅綠假單胞菌鐵的吸收之間的關(guān)系,以期在未來(lái)加深對(duì)銅綠假單胞菌致慢性感染的相關(guān)原因的理解。方法從Manoil實(shí)驗(yàn)室得到了PA0861轉(zhuǎn)座子突變體菌株和PAO1野生型菌株。首先采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction PCR)方法來(lái)確認(rèn)基因PA0861的突變位點(diǎn)。之后經(jīng)表型分析,比較突變體及野生型銅綠假單胞菌生物膜的變化。利用Microarray比較PA0861突變體菌株和PAO1野生型菌株的基因表達(dá)譜。Microarray數(shù)據(jù)首先通過GO分析基因表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù),運(yùn)用WEGO對(duì)突變體PA0861和野生型PAO1中表達(dá)不同的基因進(jìn)行對(duì)比分析。然后運(yùn)用KEGG和DAVID對(duì)PA0861可能影響的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行分析,比較銅綠假單胞菌中鐵載體合成的一系列基因,利用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析PA0861對(duì)調(diào)控鐵載體合成的影響,比色法和薄層層析色譜在基因產(chǎn)物的水平來(lái)驗(yàn)證兩個(gè)菌株鐵載體水平,從而初步分析基因PA0861是如何影響銅綠假單胞菌鐵的吸收,以及推斷c-di-GMP來(lái)調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌鐵載體的生物學(xué)作用。結(jié)果1.通過PCR反應(yīng)結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到的結(jié)果來(lái)看,A2與C2得到了明亮清晰的條帶,A2與C2的模板都是突變體PA0861,而其它樣品沒有條帶,從而可以得出由于轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)在PA0861基因上,從而導(dǎo)致其失活。2.對(duì)菌株突變體PA0861和野生型PAO1進(jìn)行表型對(duì)比分析,通過結(jié)晶紫染色生物膜定量實(shí)驗(yàn),在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)4、8、12小時(shí)的兩個(gè)菌株,統(tǒng)計(jì)得出突變體PA0861形成的生物膜在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都比野生型PAO1生成的多,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.Microarray分析銅綠假單胞菌整個(gè)基因表達(dá)譜,分析以后發(fā)現(xiàn)在突變體PA0861和野生型PAO1的比較中有2782個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生改變,其中大約有2400個(gè)基因m RNA上調(diào)382個(gè)基因下調(diào)達(dá)兩倍以上。由于上調(diào)的基因比下調(diào)基因多很多,我們校正標(biāo)準(zhǔn),選擇的標(biāo)準(zhǔn)為PA0861上調(diào)達(dá)到6倍和下調(diào)達(dá)到2.5倍才計(jì)為差異表達(dá)。FDR5%,SAM在0.05(P0.05)。結(jié)果分析導(dǎo)致上調(diào)的基因是319個(gè),下調(diào)的基因?yàn)?98個(gè)。1)通過GO分析全面比較在突變體PA0861和野生型PAO1中表達(dá)譜,初步發(fā)現(xiàn)在這517個(gè)發(fā)生變化的轉(zhuǎn)錄子中,顯著性不同的有215個(gè),占了調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌的生物學(xué)過程42%。2)利用WEGO分析突變體PA0861的生物學(xué)功能的時(shí)候,發(fā)現(xiàn)涉及到色素的基因有26個(gè)。3)利用KEGG進(jìn)行通路分析,在P0.05的情況下,除了涉及到核酸合成,細(xì)胞周期,能量產(chǎn)生等以外,最突出的在突變體PA0861中,鐵載體生物合成的基因,有5個(gè)基因被激活。4.銅綠假單胞菌中有兩個(gè)主要的鐵載體,假單胞菌素(Pyoverdine)和銅綠假單胞菌螯鐵蛋白(Pyochelin)。利用KEGG通路分析時(shí),發(fā)現(xiàn)最突出的是突變體PA0861中五個(gè)與鐵載體生物合成的基因被激活。調(diào)控Pyoverdine合成的基因位于PAO1基因組,橫跨約120kb的區(qū)段,約70個(gè)基因。我們從中挑選了11個(gè)基因,分別代表上調(diào)2倍到19倍,然后通過以GAPDH為內(nèi)參,用半定量RT-PCR的方法進(jìn)行m RNA水平的比較,結(jié)果是PA2385,PA2392,PA2394,PA2395,PA2398,PA2403,PA2443,Pvd S的表達(dá)是上調(diào),PA2388和PA2418是下調(diào),PA2444在突變體PA0861和野生型PAO1中沒有變化。對(duì)于Pyochelin,在突變體PA0861中,所有基因都上調(diào),倍數(shù)在3.86-14倍之間�？傮w上大多數(shù)基因是上調(diào)的,只有少數(shù)減少和沒變化。5.進(jìn)一步對(duì)Pyochelin運(yùn)用TLC的方法進(jìn)行半定量的比較分析,以水楊酸為標(biāo)準(zhǔn)品,并以具有PDE活性的Roc R,有DGC活性的Wsp R作對(duì)照。從結(jié)果可以看出突變體PA0861生成的Pyochelin比PAO1生成的多,與ROCR突變體合成的相近。6.通過對(duì)菌株突變株P(guān)A0861和野生型PAO1中Pyoverdine,用比色法作定量分析,得到在6小時(shí)和18小時(shí),突變體PA0861中Pyoverdine的產(chǎn)量都比野生型PAO1的多,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。說明基因PA0861可能調(diào)控鐵載體的生物合成,從而也調(diào)控銅綠假單胞菌生物膜的合成。結(jié)論我們已經(jīng)知道PA0861基因涉及c-di-GMP的合成與分解,并影響生物膜的形成。為了進(jìn)一步了解PA0861基因是通過怎樣的分子機(jī)制來(lái)影響生物膜,首先通過在轉(zhuǎn)錄的水平上對(duì)其進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)基因PA0861的失活使涉及鐵載體Pyoverdine和Pyochelin合成的基因絕大多數(shù)發(fā)生了上調(diào),說明基因PA0861可能影響對(duì)銅綠假單胞菌的鐵載體形成,由此影響了生物膜的形成,其趨勢(shì)與我們先前對(duì)基因PA0861進(jìn)行生物學(xué)表型分析的結(jié)果一致。由此的初步結(jié)論是基因PA0861調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌對(duì)鐵的吸收,為進(jìn)一步理解c-di-GMP在銅綠假單胞菌中的生物學(xué)功能提供一些啟示。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌 c-di-GMP PA0861 生物膜 鐵載體
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378;Q78
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 中英文縮略詞表11-13
• 前言13-15
• 材料與方法15-27
• 結(jié)果27-34
• 討論34-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-43
• 綜述43-57
• 綜述參考文獻(xiàn)52-57
• 致謝57-58
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷58

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 林曉 ,陳美云 ,林其昌 ,陳公平;222株銅綠假單胞菌藥敏結(jié)果[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2002年10期

2 王炳華;王炳云;;106株銅綠假單胞菌藥敏結(jié)果分析[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2004年06期

3 黃志強(qiáng);李麗君;盧娟;;肺結(jié)核病合并感染銅綠假單胞菌的藥敏分析[J];臨床肺科雜志;2010年09期

4 封尊玉;;銅綠假單胞菌的治療策略[J];海南醫(yī)學(xué);2010年21期

5 劉萍;張志倫;倪丹妮;吳杰紅;;銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶因素分析[J];中華醫(yī)院感染學(xué)雜志;2011年23期

6 吳麗娟,熊爾陽(yáng),鄧光貴;聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)銅綠假單胞菌的研究現(xiàn)狀[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè);1996年06期

7 周鐵麗,曹建明;一種鑒定銅綠假單胞菌的新方法[J];陜西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn);1997年04期

8 朱小平;78株銅綠假單胞菌藥敏結(jié)果的初步探討[J];江蘇臨床醫(yī)學(xué)雜志;1999年05期

9 孫東華,邊瑞巖,孫躍軍,王慶敏;銅綠假單胞菌污染礦泉水調(diào)查分析[J];環(huán)境與健康雜志;2000年04期

10 張文英;86株銅綠假單胞菌的耐藥調(diào)查[J];華夏醫(yī)學(xué);2000年04期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 方莉;許媛;黃義山;蔡燕;唐中;楊明輝;廖濤;;銅綠假單胞菌金屬β-內(nèi)酰胺酶基因的檢測(cè)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)臨床檢驗(yàn)管理專業(yè)委員會(huì)第六屆全國(guó)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

2 周明明;周鐵麗;李超;吳慶;陳櫟江;吳蓮鳳;彭定輝;;主動(dòng)外排在銅綠假單胞菌耐藥中的作用研究[A];2009年浙江省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

3 陳邦;王琰;茍曉峰;陳林;;嘧霉胺對(duì)銅綠假單胞菌基因的調(diào)節(jié)[A];第六屆全國(guó)化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

4 朱丹;李欣;;對(duì)亞胺培南耐藥的銅綠假單胞菌的體外藥敏分析[A];2005年浙江省呼吸系病學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2005年

5 洪波;貢聯(lián)兵;;銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的藥敏分析[A];第五次全國(guó)中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

6 徐海茹;田彬;岳娜;胡志東;;臨床分離的銅綠假單胞菌耐藥結(jié)果分析[A];第五次全國(guó)中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

7 趙書平;姜梅杰;;神經(jīng)內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)室銅綠假單胞菌氨基糖苷類修飾酶基因研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

8 張杜超;方向群;;微重力對(duì)銅綠假單胞菌毒力影響及與肺部感染關(guān)系[A];2011年空間生命與生命起源暨航天醫(yī)學(xué)工程學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

9 李春梅;鐘曉祝;;銅綠假單胞菌醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)分析[A];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)消毒分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2010年

10 熊娟;梁麗紅;;尿液中分離出產(chǎn)紅膿素的銅綠假單胞菌[A];2012全國(guó)臨床微生物與感染免疫學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 俞云松;銅綠假單胞菌耐藥全國(guó)流行[N];健康報(bào);2008年

2 李曙平;銅綠假單胞菌 老年病房的主要致病菌[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

3 王振嶺;銅綠假單胞菌耐藥問題嚴(yán)重[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年

4 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科 胡志東;關(guān)注銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥[N];健康報(bào);2009年

5 ;碳青霉烯類抗生素[N];農(nóng)村醫(yī)藥報(bào)（漢）;2007年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張瑞琴;氟喹諾酮類藥物誘導(dǎo)銅綠假單胞菌耐藥性及分子機(jī)制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

2 張若文;燒傷病房耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2012年

3 張亞妮;谷胱甘肽與銅綠假單胞菌致病性及抗生素抗性的關(guān)系研究[D];西北大學(xué);2009年

4 陳林;銅綠假單胞菌內(nèi)在耐藥性相關(guān)基因的篩選及研究[D];西北大學(xué);2010年

5 李學(xué)如;銅綠假單胞菌耐喹諾酮類藥物的分子機(jī)制研究[D];四川大學(xué);2003年

6 徐洋洋;銅綠假單胞菌致病性受信號(hào)分子調(diào)控及其機(jī)理研究[D];西北大學(xué);2013年

7 徐令清;銅綠假單胞菌對(duì)微生物的抑制作用及機(jī)理探討[D];華中科技大學(xué);2014年

8 魏殿軍;臨床分離菌株耐藥性分析及銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的探討[D];天津醫(yī)科大學(xué);2004年

9 郭俏;銅綠假單胞菌致病因子抑制劑及喹諾酮信號(hào)分子介導(dǎo)的調(diào)節(jié)途徑研究[D];西北大學(xué);2013年

10 孫小敏;氨溴索對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜密度感應(yīng)系統(tǒng)的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 吳蘇敏;光動(dòng)力療法抗多重耐藥銅綠假單胞菌感染的研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

2 賈子中;黃連素對(duì)燒傷創(chuàng)面銅綠假單胞菌生物膜干預(yù)試驗(yàn)及自制中藥臨床應(yīng)用觀察[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

3 王穎;新型抗耐藥革蘭氏陰性菌藥物的篩選研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

4 馬超;無(wú)機(jī)鎵化合物抗菌性能研究[D];西南交通大學(xué);2015年

5 李九龍;PA0861在銅綠假單胞菌PAO1中作用的研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

6 梁紅梅;銅綠假單胞菌ATCC27853對(duì)秀麗隱桿線蟲的毒性研究[D];蘭州大學(xué);2015年

7 胡凡;銅綠假單胞菌的耐藥表型與耐藥基因型研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 王貴年;銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的臨床調(diào)查研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2008年

9 劉蓉;臨床分離的銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的分子機(jī)理的研究[D];四川大學(xué);2006年

10 章喻軍;銅綠假單胞菌外膜耐藥和保護(hù)原功能蛋白組學(xué)的研究[D];廈門大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：PA0861在銅綠假單胞菌PAO1中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：409887