發(fā)布時(shí)間：2017-05-30 03:00

  本文關(guān)鍵詞：PrxI在大鼠腎缺血再灌注損傷模型肝內(nèi)的表達(dá)變化，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腎臟是人體內(nèi)主要的分泌排泄器官,它不僅參與代謝廢物排泄、激素分泌,還可以維持水電解質(zhì)以及酸堿平衡。有研究表明:當(dāng)腎臟功能受損時(shí),其鄰近和遠(yuǎn)端器官如:心、肺、肝、腸和腦等的功能也會(huì)嚴(yán)重受損。腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是一種常見(jiàn)的病理生理現(xiàn)象,多見(jiàn)于高血壓、腎外科手術(shù)期間等,它也是導(dǎo)致腎移植后功能恢復(fù)延遲、病人愈后較差、甚至腎功能衰竭的重要因素。有研究表明:氧化應(yīng)激是導(dǎo)致RIRI發(fā)生的主要病理機(jī)制之一。缺血再灌注時(shí)腎臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài),會(huì)有大量活性氧族(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生。ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH-)和過(guò)氧化氫(H2O2)等;ROS化學(xué)性質(zhì)非常活潑,可以破壞細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA和脂類等生物大分子,從而影響細(xì)胞功能,甚至引起細(xì)胞和組織死亡。Peroxiredoxin(Prx)蛋白是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類過(guò)氧化物酶系,廣泛存在于各種原核和真核生物細(xì)胞中。到目前為止,在哺乳動(dòng)物中共找到6個(gè)家族成員,Prx I是其成員之一,在肝臟表達(dá)最高,主要負(fù)責(zé)還原過(guò)氧化物或超氧化物,保護(hù)細(xì)胞和組織免遭氧化應(yīng)激損傷,在清除ROS中具有重要作用。肝臟也是人體內(nèi)的重要器官之一,它不僅參與多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝反應(yīng),還具有分泌、解毒、排泄等重要功能。當(dāng)腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生并產(chǎn)生大量ROS的同時(shí),是否會(huì)使鄰近器官肝臟也遭受氧化應(yīng)激損傷?抗氧化酶Prx I的基因和蛋白表達(dá)水平又如何改變?均未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)采用無(wú)損傷動(dòng)脈夾鉗夾腎動(dòng)脈法建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型。24小時(shí)后觀察血清ALT含量、肝臟組織的形態(tài)學(xué)改變,肝臟內(nèi)MDA含量,Prx I基因水平和蛋白水平的表達(dá)變化,探討腎臟缺血再灌注損傷時(shí)肝臟的功能和形態(tài)學(xué)改變,過(guò)氧化損傷程度,Prx I在缺血再灌注損傷過(guò)程中的抗氧化作用,為防治RIRI引起的肝臟損傷提供一條新思路。目的:觀察大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型肝內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)和抗氧化酶Prx I基因和蛋白水平的表達(dá)變化,探討Prx I在RIRI誘發(fā)的肝臟過(guò)氧化損傷中的作用。方法:1腎臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材雄性Wister大鼠12只,體重200±10 g,購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)和腎臟缺血再灌注損傷組(RIRI),每組各6只。用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg),參照余曉東等人的方法制備腎臟缺血再灌注損傷模型。RIRI組大鼠開(kāi)腹后暴露其雙側(cè)腎臟,先切除右腎,然后鈍性分離左腎動(dòng)脈,在靠近腎門處用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈,觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色。45 mins后松開(kāi)動(dòng)脈夾,恢復(fù)血液供應(yīng),肉眼可見(jiàn)腎動(dòng)脈充盈,腎臟由暗紅色迅速變?yōu)轷r紅色,表明再灌注成功。對(duì)照組大鼠開(kāi)腹后只切除右腎,分離左腎動(dòng)脈,但不夾閉左腎動(dòng)脈。24小時(shí)后收集血液,3000rpm離心10min,分離血清用于血清肌酐(Serum Creatinine,SCr)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN),丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine Aminotransferase,ALT)濃度測(cè)定;處死大鼠取腎臟和肝臟,一部分4%多聚甲醛中固定進(jìn)行HE染色,觀察腎臟和肝臟的形態(tài)學(xué)改變。一部分肝臟置于液氮中用于Prx I m RNA和蛋白水平測(cè)定以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測(cè)定。2測(cè)定指標(biāo)及方法2.1血清ALT、SCr和BUN水平測(cè)定血清ALT水平由全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定;血清SCr濃度采用苦味酸法測(cè)定;血清BUN濃度采用酶偶聯(lián)速率法測(cè)定。2.2 HE染色觀察大鼠腎臟和肝臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)腎臟和肝臟組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明,石蠟包埋后,切片厚約5μm,蘇木精伊紅染色,日本產(chǎn)Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織和腎臟的形態(tài)變化并進(jìn)行圖象分析。2.3大鼠肝組織MDA含量測(cè)定將從-70℃冰箱中取出的肝組織按照10mg/100μl加入預(yù)冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液,PH7.4,1mmol/L鹽酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm 4℃離心20min,取上清即制成10%肝組織勻漿,肝組織勻漿內(nèi)MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒測(cè)定。2.4大鼠肝組織Prx I m RNA水平測(cè)定用TRIzol法提取肝內(nèi)總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成c DNA。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照,進(jìn)行RT-PCR。分別以Prx I的擴(kuò)增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量2.5大鼠肝組織Prx I蛋白水平測(cè)定采用Western blot法測(cè)定大鼠肝組織Prx I蛋白水平。將大鼠肝組織制成勻漿,離心后取上清。用改良Lowry法進(jìn)行蛋白總量測(cè)定.電泳的蛋白上樣量為58 ug.經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜和封閉處理后,在PVDF膜上加入兔抗Prx I抗體,室溫靜置過(guò)夜。再加入熒光標(biāo)記的抗兔Ig G抗體.在雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進(jìn)行圖像數(shù)值分析。結(jié)果:1大鼠腎組織和肝組織的形態(tài)學(xué)改變光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)正常組大鼠腎血管球、腎小囊、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管及集合管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整。而RIRI組大鼠可見(jiàn)腎血管球萎縮,體積變小;腎小囊腔擴(kuò)張;腎小管管腔明顯擴(kuò)張,個(gè)別近曲小管上皮細(xì)胞水腫,胞漿疏松化;腎間質(zhì)水腫,腎小管間隙擴(kuò)大;集合管出現(xiàn)管腔擴(kuò)張、上皮水腫等改變。對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞索排列整齊、染色均勻,未見(jiàn)異常;RIRI組大鼠肝細(xì)胞索排列欠整齊、染色較對(duì)照組淺、肝血竇略有擴(kuò)張。2血清ALT水平Con組大鼠血清中ALT活性為19.8±3.76U/L,而RIRI組血清ALT活性為64.3±7.92 U/L。RIRI組大鼠血清ALT活性明顯高于Con組(P0.01)。3血清SCr水平Con組大鼠血清中SCr的濃度為103.444±8.465μmol/L,而RIRI組血清SCr的濃度為131.153±17.814μmol/L。RIRI組大鼠血清SCr濃度明顯高于Con組(P0.05)。4血清BUN水平Con組大鼠血清BUN的濃度為4.462±0.541 mmol/L,而RIRI組血清BUN的濃度為13.685±4.397 mmol/L。RIRI組大鼠血清BUN的濃度明顯高于Con組(P0.05)。5肝漿內(nèi)MDA的含量Con組大鼠肝勻漿內(nèi)的MDA含量為9.03±2.11mmol/g,而RIRI組肝勻漿內(nèi)的MDA含量為16.12±1.89 mmol/g。RIRI組大鼠肝勻漿內(nèi)的MDA含量明顯高于Con組(P0.01)。6肝組織Prx I m RNA的相對(duì)表達(dá)量采用RT-PCR的方法測(cè)定大鼠肝組織內(nèi)Prx I m RNA的相對(duì)表達(dá)量。Con組肝組織內(nèi)Prx I m RNA的相對(duì)表達(dá)量為0.75±0.18,RIRI肝組織內(nèi)Prx I m RNA的相對(duì)表達(dá)量為1.23±0.21,RIRI組大鼠肝組織內(nèi)Prx I m RNA水平明顯高于Con組(P0.01)。說(shuō)明RIRI組大鼠肝組織內(nèi)Prx I的基因表達(dá)水平升高。7大鼠肝組織Prx I蛋白水平Con組大鼠肝組織內(nèi)Prx I的蛋白表達(dá)水平為0.69±0.13,RIRI組大鼠肝組織內(nèi)Prx I的蛋白表達(dá)水平為1.04±0.16。RIRI組Prx I蛋白水平明顯高于對(duì)照組(P0.01)。說(shuō)明RIRI組大鼠肝組織內(nèi)Prx I的蛋白表達(dá)水平升高。結(jié)論:1切除右腎后在靠近腎門處用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉左腎動(dòng)脈可成功建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。2腎臟缺血再灌注損傷可使鄰近器官肝臟遭受氧化應(yīng)激損傷,形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能受損。3 Prx I的基因和蛋白表達(dá)水平在RIRI模型肝臟中明顯增強(qiáng)。提示Prx I可能參與了缺血再灌注所誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng),對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)功能。
【關(guān)鍵詞】：缺血再灌注損傷 PrxI MDA ALT 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R692;R-332
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-14
• 英文縮寫(xiě)14-15
• 前言15-16
• 材料與方法16-24
• 結(jié)果24-26
• 附圖26-33
• 附表33-36
• 討論36-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-40
• 綜述 應(yīng)激的研究進(jìn)展40-51
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 致謝51-52
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷52

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本文編號(hào)：406193