乙型肝炎(Hepatitis B,HB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的世界范圍的傳染性疾病,其囊膜蛋白乙肝表面抗原(Hepatitis B surface antigen,HBsAg)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體乙肝表面抗體(Hepatitis B surface antibody,HBsAb),是乙肝疫苗的主要成分。同時(shí),HBsAg也是ELISA診斷免疫是否成功的主要試劑成分。大量制備HBsAg在預(yù)防和檢測(cè)方面有重要意義。本實(shí)驗(yàn)開展了HBsAg的體外表達(dá)及表達(dá)后初步純化、應(yīng)用的研究工作。 從已確診的乙肝病人血清中提取DNA,利用Primer 5.0,參照GeneBank發(fā)表的序列,設(shè)計(jì)針對(duì)編碼HBsAg S基因的特異性引物。PCR擴(kuò)增S基因,將其分別克隆入畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)載體pPICZB和分泌型表達(dá)載體pPICZaA中,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPICZS和pPICZaS。構(gòu)建的重組子經(jīng)SacI線性化后,電轉(zhuǎn)化入酵母菌株GS115。利用抗生素Zeocin篩選重組子,誘導(dǎo)表達(dá)后,進(jìn)行Western-blot,ELISA鑒定。結(jié)果表明,...

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
縮略語表
第一章 綜述
    1. 乙型肝炎及其流行病學(xué)
    2. 乙型肝炎病毒
        2.1 乙肝病毒發(fā)現(xiàn)史
        2.2 乙肝病毒的分子生物學(xué)特征
        2.3 HBV感染的機(jī)理
    3. 乙肝表面抗原
        3.1 乙肝表面抗原的存在形式
        3.2 乙肝表面抗原的特征
        3.3 乙肝表面抗原的作用
    4. 基因工程 HBsAg的制備
        4.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)
        4.2 酵母表達(dá)系統(tǒng)
        4.3 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)
        4.4 病毒表達(dá)系統(tǒng)
        4.5 植物表達(dá)系統(tǒng)
    5. 立題背景及意義
第二章 乙肝表面抗原在畢赤酵母中的表達(dá)
    1. 材料
        1.1 菌株和表達(dá)載體
        1.2 常用的材料與試劑
        1.3 主要試劑配方
        1.4 儀器和設(shè)備
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 病毒 DNA模板的獲取
        2.2 引物設(shè)計(jì)與合成
        2.3 PCR擴(kuò)增 HBVS基因
        2.4 E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl₂法)
        2.5 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.6 電轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.7 真核表達(dá)載體的線性化
        2.8 真核表達(dá)載體的電轉(zhuǎn)化
        2.9 重組酵母菌表型的篩選
        2.10 重組酵母菌的鑒定
    3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建策略
        3.2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果
        3.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
        3.4 重組質(zhì)粒的測(cè)序分析
        3.5 重組質(zhì)粒的線性化結(jié)果
        3.6 SDS-PAGE分析表達(dá)結(jié)果
        3.7 Western-blot分析表達(dá)結(jié)果
        3.8 ELISA分析表達(dá)結(jié)果
    4. 討論
第三章 乙肝表面抗原在原核表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌)中的表達(dá)
    1. 材料
        1.1 菌株和表達(dá)載體
        1.2 常用的材料與試劑
        1.3 主要試劑配方
        1.4 儀器和設(shè)備
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 引物設(shè)計(jì)與合成
        2.2 PCR擴(kuò)增HBVS基因
        2.3 原核重組質(zhì)粒pRSETBS的構(gòu)建
        2.4 重組工程菌的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)
        2.5 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定
    3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建策略
        3.2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果
        3.3 重組質(zhì)粒pRSETBS的酶切鑒定
        3.4 重組質(zhì)粒的測(cè)序分析
        3.5 SDS-PAGE分析表達(dá)結(jié)果
        3.6 Western-blot分析表達(dá)結(jié)果
    4. 討論
第四章 畢赤酵母表達(dá)乙肝表面抗原的純化及應(yīng)用
    1. 材料
        1.1 菌株
        1.2 常用的材料與試劑
        1.3 主要試劑配方
        1.4 儀器和設(shè)備
    2. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 GS115-pPICZS最佳收獲時(shí)間的確定
        2.2 GS115-pPICZS表達(dá)量的粗略確定
        2.3 GS115-pPICZS大量誘導(dǎo)表達(dá)
        2.4 Ni-NTA親和層析純化
        2.5 SDS-RAGE后銀染分析
        2.6 Western-blot分析純化后蛋白的活性
        2.7 Bradford法測(cè)純化后蛋白的濃度
        2.8 純化蛋白的應(yīng)用
    3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 最佳收獲時(shí)間的確定
        3.2 表達(dá)量的粗略估算
        3.3 銀染分析 Ni-NTA 純化的目的蛋白
        3.4 Western-blot分析純化蛋白
        3.5 Bradford法測(cè)純化蛋白的濃度
        3.6 純化蛋白的應(yīng)用
    4. 討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：4027735