本文關(guān)鍵詞：REGγ對(duì)不同信號(hào)傳導(dǎo)功能的調(diào)節(jié)及其病理生理意義，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：REG γ亦稱PSME3,PA28γ,是由PSME3編碼的一種細(xì)胞核蛋白,在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病人血清中初次發(fā)現(xiàn),可被自身免疫系統(tǒng)識(shí)別。REG γ屬11S蛋白酶體激活因子家族,與20S蛋白酶體結(jié)合,可參與多種類型蛋白質(zhì)的非泛素化非ATP依賴的降解。已有研究表明,REG γ可以介導(dǎo)多種細(xì)胞周期蛋白P21,P16,CK1δ等的降解,也可參與類固醇受體激活因子SRC3,轉(zhuǎn)錄因子NF-kB抑制因子IkBs的降解,調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄,對(duì)機(jī)體各項(xiàng)生理功能意義重大。本文主要研究REG γ對(duì)精神分裂癥相關(guān)蛋白GSK3 β和能量代謝相關(guān)蛋白AMPK關(guān)系的初步探究。首先,我們?cè)谛∈笮袨閷W(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),REG γ敲除的小鼠認(rèn)知能力和行為能力跟正常小鼠存在一定差異,顯示出精神分裂癥的類似癥狀。據(jù)報(bào)道,在精分患者的海馬區(qū),GSK3 β較正常人表達(dá)水平高,跟REG γ敲除小鼠海馬區(qū)情況一致,但RNA水平?jīng)]有顯著差異。在抗體芯片試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)GSK3 β是的直接底物。我們通過檢測(cè)多種GSK3 β的底物蛋白水平,發(fā)現(xiàn)β-catenin在敲除REG γ的小鼠組織內(nèi)含量較低。之后我們?cè)谇贸齊EG γ的人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了同樣的情況,暗示我們REG γ可能通過降解GSK3 β來(lái)調(diào)控β-catenin水平,控制下游基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。我們?cè)诘鞍酌庖吖渤恋砗图?xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)REG γ可以跟GSK3 β發(fā)生共定位現(xiàn)象,進(jìn)一步證實(shí)了我們的猜測(cè),為精神分裂癥的治療提供了理論依據(jù)。大腦作為人體最重要的組織器官,通過神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)機(jī)體各項(xiàng)生理活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控,其腦部充足的能量供應(yīng)為機(jī)體的穩(wěn)態(tài)提供條件。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)在神經(jīng)瘤母細(xì)胞中,AMPK作為調(diào)節(jié)能量代謝的關(guān)鍵蛋白,其磷酸化水平受REG γ的直接調(diào)控。為驗(yàn)證REG γ對(duì)能量調(diào)節(jié)的普遍性,我們對(duì)小鼠進(jìn)行了另一種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)在小鼠的肌肉耐力行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,REG γ敲除的小鼠耐力高于正常小鼠,腓腸肌的肌肉切片SDH染色結(jié)果顯示,敲除REG γ小鼠的琥珀酸脫氫酶表達(dá)明顯高于正常小鼠。琥珀酸脫氫酶作為三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶,是線粒體氧化能力和數(shù)目的標(biāo)志,受腺苷酸活化蛋白激酶AMPK的調(diào)控。我們?cè)诘鞍姿綄?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)敲除REGγ的長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的小鼠組織中,磷酸化AMPK水平明顯高于正常小鼠,與線粒體氧化相關(guān)的基因PGC1-α, CPT-1b, Nampt, MFN, MCD等在RNA水平高于正常小鼠。饑餓小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致�？贵w芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AMPK是REG γ的直接底物蛋白,于是我們?cè)诩?xì)胞水平進(jìn)行進(jìn)一步研究。饑餓處理敲除REG γ的穩(wěn)轉(zhuǎn)成肌細(xì)胞系發(fā)現(xiàn),磷酸化AMPK水平較REGγ正常細(xì)胞高,用AMPK激活因子AICAR、AMP處理細(xì)胞有相似結(jié)果,與線粒體氧化有關(guān)的多種蛋白在RNA水平上都相對(duì)較高。我們?cè)贖epG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系和成纖維細(xì)胞系中得到了類似的結(jié)果。為進(jìn)一步證明REG γ是否直接調(diào)控AMPK,我們用DOX(潮霉素)誘導(dǎo)293WT細(xì)胞過表達(dá)REG γ后,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)REG γ使AMPK總體水平無(wú)顯著差異,但活性AMPK水平較低,敏感性較差。暗示我們REG γ可能會(huì)直接參與磷酸化AMPK的降解,進(jìn)而對(duì)線粒體氧化產(chǎn)生影響,對(duì)肌肉耐力的提高有一定的抑制作用。這一研究表明,REG γ-AMPK途徑會(huì)影響線粒體的功能數(shù)目,繼而影響細(xì)胞能量代謝,此調(diào)控具有普遍性。
【關(guān)鍵詞】：REGγ GSK3β 精神分裂癥 AMPK 細(xì)胞能量代謝
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 綜述13-30
• 1. 蛋白質(zhì)降解13-16
• 1.1 蛋白酶體13-15
• 1.2 泛素依賴的蛋白酶體降解15-16
• 1.3 非泛素化依賴的蛋白質(zhì)降解16
• 1.4 蛋白酶體降解的意義16
• 2. REGγ16-21
• 2.1 REG及REG γ16-18
• 2.2 REG γ生物學(xué)功能18-21
• 3. 精神分裂癥21-25
• 3.1 精神分裂癥簡(jiǎn)介21
• 3.2 分子機(jī)制21-25
• 4. 氧化代謝與AMPK25-30
• 4.1 線粒體生物功能與肌肉功能25-26
• 4.2 AMPK與線粒體功能26-30
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法30-44
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料30-32
• 1.1 小鼠30
• 1.2 細(xì)胞系30
• 1.3 感受態(tài)30
• 1.4 實(shí)驗(yàn)試劑和器材30-31
• 1.5 抗體31
• 1.6 引物31-32
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法32-44
• 2.1 小鼠基因型鑒定32-33
• 2.2 小鼠跑臺(tái)訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)33-34
• 2.3 細(xì)胞培養(yǎng),凍存,復(fù)蘇34
• 2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染34
• 2.5 質(zhì)粒構(gòu)建與質(zhì)粒提取34-36
• 2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)36-37
• 2.7 蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)37-38
• 2.8 定量PCR38-40
• 2.9 冰凍切片(用于SDH染色)40
• 2.10 SDH染色40
• 2.11 免疫熒光40-41
• 2.12 核質(zhì)分離41
• 2.13 嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系(shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)41-44
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析44-69
• 第一部分 REGγ對(duì)精神分裂癥重要蛋白GSK3β的調(diào)控44-54
• 第一節(jié) REGγ對(duì)精神分裂癥重要蛋白GSK3β蛋白表達(dá)的影響44-48
• 1.1 REGγ對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSK3β基因的影響44-45
• 1.2 REGγ對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSK3β蛋白水平的影響45-46
• 1.3 REGγ對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSK3β活性影響46-47
• 1.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)47-48
• 第二節(jié) REGγ對(duì)GSK3β及其底物蛋白降解的影響48-50
• 2.1 REGγ對(duì)GSK3β蛋白降解的影響48
• 2.2 REG Y對(duì)GSK3 p底物蛋白降解的影響48-49
• 2.3 實(shí)驗(yàn)小結(jié)49-50
• 第三節(jié) REGγ對(duì)GSK3β作用區(qū)域的初步探究50-52
• 3.1 核質(zhì)分離探究REGγ與GSK3β相互作用的亞細(xì)胞定位50-51
• 3.2 細(xì)胞免疫熒光探究REGγ與GSK3β的亞細(xì)胞定位51-52
• 3.3 Co-IP實(shí)驗(yàn)探究REGγ與GSK3β的關(guān)系52
• 3.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)52
• 第四節(jié) 實(shí)驗(yàn)總結(jié)52-53
• 第五節(jié) 展望53-54
• 第二部分 REGγ對(duì)肌肉功能及線粒體活性影響的初步探究54-69
• 第一節(jié) REGγ對(duì)小鼠肌肉功能的影響54-58
• 1.1 REGγ對(duì)小鼠動(dòng)物跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)和游泳實(shí)驗(yàn)表型的影響54-55
• 1.2 REGγ對(duì)小鼠肌肉線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控55-56
• 1.3 REGγ對(duì)運(yùn)動(dòng)小鼠肌肉中AMPK活性的調(diào)控56-57
• 1.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)57-58
• 第二節(jié) REGγ對(duì)饑餓小鼠肌肉能量代謝的影響58-59
• 2.1 REGv對(duì)小鼠饑餓后線粒體功能的影響58
• 2.2 REGy對(duì)小鼠饑餓后AMPK功能的影響58-59
• 2.3 實(shí)驗(yàn)小結(jié)59
• 第三節(jié) REGγ對(duì)細(xì)胞中能量代謝的影響59-65
• 3.1 REGγ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞中能量代謝的影響59-61
• 3.2 REGγ對(duì)肝細(xì)胞中能量代謝的影響61-63
• 3.3 REGγ對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中能量代謝的影響63-65
• 3.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)65
• 第四節(jié) REGγ調(diào)控AMPK介導(dǎo)能量代謝機(jī)制的初步探究65-67
• 4.1 蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)REGγ與AMPK的互作關(guān)系65-66
• 4.2 誘導(dǎo)REGγ高表達(dá)研究REGγ與AMPK的關(guān)系66-67
• 4.3 實(shí)驗(yàn)小結(jié)67
• 第五節(jié) 實(shí)驗(yàn)總結(jié)67
• 第六節(jié) 展望67-69
• 參考文獻(xiàn)69-76
• 致謝76

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