本文關(guān)鍵詞：microRNA-17抑制人包皮成纖維細(xì)胞衰老的作用及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)胞衰老(cellular senescence)是細(xì)胞進(jìn)入一種周期不可逆轉(zhuǎn)的停滯而達(dá)到的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。細(xì)胞衰老主要受到p53-p21通路和p16-pRb通路的調(diào)控,當(dāng)這兩條通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子如p21蛋白表達(dá)下降或細(xì)胞周期蛋白cyclinD的蛋白表達(dá)上調(diào)時(shí),細(xì)胞可以延緩衰老或繞過衰老程序繼續(xù)增殖。miR-17家族,亦可稱為miR-106b家族,是由6個(gè)序列相似,結(jié)構(gòu)相仿,種子區(qū)序列相同(AAAGUGCU),物種間高度保守的成熟體miRNA組成。miR-17可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F家族和pRb蛋白水平的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期來影響細(xì)胞的增殖生長(zhǎng),提示miR-17在細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要作用。但是miR-17上游和下游的調(diào)控因子和機(jī)制還不十分明確。因此研究miR-17調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老的作用與機(jī)制,對(duì)于研究和治療衰老相關(guān)疾病,探索腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)理有著重要意義。研究目的：1.人包皮成纖維細(xì)胞(human foreskin fibroblasts, HFF)體外分離培養(yǎng)、生長(zhǎng)與傳代并觀察各代HFF的增殖規(guī)律和特點(diǎn)。2.研究miR-17對(duì)HFF細(xì)胞衰老的影響。3.明確miR-17對(duì)HFF細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。4.研究miR-17對(duì)HFF細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)控作用。研究方法：1.無菌取7歲患者的手術(shù)切除的包皮,利用DispaseⅡ酶消化的方法獲得較高純度的HFF,并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3代HFF,用兔抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體作為一抗,采用免疫組織化學(xué)SABC法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。2.慢病毒感染HFF 72h后,熒光倒置顯微鏡觀察HFF-miR-17及HFF-NC細(xì)胞中GFP的表達(dá),并拍照。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)HFF-miR-17及HFF-NC中miR-17的表達(dá)情況。3.通過CCK-8法觀察HFF-miR-17和HFF-NC生長(zhǎng)變化,并繪制細(xì)胞增殖曲線。衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶染色法檢測(cè)HFF-miR-17和HFF-NC細(xì)胞中衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶的表達(dá)情況。4.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HFF-miR-17與HFF-NC細(xì)胞周期的變化情況。利用Western blotting檢測(cè),空白對(duì)照細(xì)胞HFF、陰性對(duì)照細(xì)胞HFF-NC和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞HFF-miR-17中p21和cyclinDl蛋白表達(dá)水平。研究結(jié)果：1.采用SABC法對(duì)細(xì)胞行免疫化學(xué)染色,實(shí)驗(yàn)組用兔抗人波形蛋白單克隆抗體作為一抗,顯微鏡下觀察可見,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多角形,細(xì)胞胞漿呈棕色染色,提示其為HFF細(xì)胞。2. 慢病毒感染HFF 72h后,熒光顯微鏡下檢測(cè)到綠色熒光分布于細(xì)胞內(nèi),與光學(xué)顯微鏡下同一視野對(duì)比,熒光示感染效率達(dá)90%,提示感染成功。慢病毒感染HFF 72h后,利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)到感染了Lenti-miR-17的細(xì)胞與感染了Lenti-NC的細(xì)胞相比,miR-17表達(dá)明顯上調(diào),二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.通過CCK-8法觀察HFF細(xì)胞生長(zhǎng)的變化。與陰性細(xì)胞HFF-NC相比,穩(wěn)定表達(dá)miR-17的HFF-miR-17細(xì)胞在450nm處的吸光度值連續(xù)六天均明顯升高,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表明miR-17能夠促進(jìn)HFF細(xì)胞的增殖能力。4.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶染色,HFF-miR-17細(xì)胞顯示出較弱的衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶染色,不到1%的細(xì)胞被染成藍(lán)色,提示此時(shí)細(xì)胞為正常細(xì)胞；而對(duì)照細(xì)胞HFF-NC中有高達(dá)20%的細(xì)胞被染成藍(lán)色,表明細(xì)胞已衰老,提示miR-17的表達(dá)顯著抑制了細(xì)胞的衰老。5.利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期,結(jié)果顯示HFF-miR-17細(xì)胞與對(duì)照HFF-NC相比,停滯在G1期的細(xì)胞明顯減少(81.5% vs 72.6%)；用DNA破壞物質(zhì)Bleomycin處理細(xì)胞后,72.9%的HFF-NC細(xì)胞停滯在G1期,僅有2.5%的HFF-NC細(xì)胞能夠越過G1期進(jìn)入S期,而HFF-miR-17細(xì)胞停滯在G1期的比例顯著減少(54.6%),進(jìn)入S期的增多(10.2%),說明miR-17促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行增殖且能越過藥物誘導(dǎo)的G1 arrest。另外所有流式結(jié)果圖中均沒有出現(xiàn)凋亡峰,說明miR-17不是通過抑制細(xì)胞的凋亡促進(jìn)細(xì)胞增殖的。6. Western blotting檢測(cè)顯示,與空白對(duì)照HFF細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞HFF-NC相比,p21蛋白表達(dá)水平在HFF-miR-17中下調(diào),而cyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著升高,說明miR-17能夠通過調(diào)控p21和cyclinD1蛋白表達(dá)水平,促進(jìn)原代細(xì)胞的增殖,抑制原代細(xì)胞的衰老。研究結(jié)論：1.利用Dispase Ⅱ酶消化的方法能獲得較高純度的HFF,并首次用慢病毒感染系統(tǒng)成功構(gòu)建了在人包皮成纖維細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)miR-17的細(xì)胞系。2.miR-17能夠抑制HFF細(xì)胞的衰老。3.miR-17能夠促使HFF由G1期進(jìn)入S期,促進(jìn)細(xì)胞的增殖。4.miR-17能夠調(diào)控HFF中p21和cyclinD1蛋白表達(dá)水平,促進(jìn)原代細(xì)胞的增殖,抑制原代細(xì)胞的衰老。
【關(guān)鍵詞】：人包皮成纖維細(xì)胞 衰老 miR-17 細(xì)胞周期 p21
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號(hào)說明13-15
• 前言15-21
• 材料21-27
• 方法27-37
• 結(jié)果37-40
• 討論40-44
• 結(jié)論44-45
• 附圖45-51
• 參考文獻(xiàn)51-59
• 致謝59-60
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文60-61
• 附件61

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