本文關鍵詞：microRNA-17抑制人包皮成纖維細胞衰老的作用及機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細胞衰老(cellular senescence)是細胞進入一種周期不可逆轉的停滯而達到的相對穩(wěn)定狀態(tài)。細胞衰老主要受到p53-p21通路和p16-pRb通路的調控,當這兩條通路中的關鍵調控因子如p21蛋白表達下降或細胞周期蛋白cyclinD的蛋白表達上調時,細胞可以延緩衰老或繞過衰老程序繼續(xù)增殖。miR-17家族,亦可稱為miR-106b家族,是由6個序列相似,結構相仿,種子區(qū)序列相同(AAAGUGCU),物種間高度保守的成熟體miRNA組成。miR-17可以通過調節(jié)轉錄調控因子E2F家族和pRb蛋白水平的表達,進而調控細胞周期來影響細胞的增殖生長,提示miR-17在細胞衰老中發(fā)揮重要作用。但是miR-17上游和下游的調控因子和機制還不十分明確。因此研究miR-17調節(jié)細胞衰老的作用與機制,對于研究和治療衰老相關疾病,探索腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機理有著重要意義。研究目的：1.人包皮成纖維細胞(human foreskin fibroblasts, HFF)體外分離培養(yǎng)、生長與傳代并觀察各代HFF的增殖規(guī)律和特點。2.研究miR-17對HFF細胞衰老的影響。3.明確miR-17對HFF細胞周期的調節(jié)。4.研究miR-17對HFF細胞周期相關蛋白的調控作用。研究方法：1.無菌取7歲患者的手術切除的包皮,利用DispaseⅡ酶消化的方法獲得較高純度的HFF,并進行傳代培養(yǎng)。取第3代HFF,用兔抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體作為一抗,采用免疫組織化學SABC法對細胞進行鑒定。2.慢病毒感染HFF 72h后,熒光倒置顯微鏡觀察HFF-miR-17及HFF-NC細胞中GFP的表達,并拍照。利用實時定量PCR技術檢測HFF-miR-17及HFF-NC中miR-17的表達情況。3.通過CCK-8法觀察HFF-miR-17和HFF-NC生長變化,并繪制細胞增殖曲線。衰老相關p-半乳糖苷酶染色法檢測HFF-miR-17和HFF-NC細胞中衰老相關p-半乳糖苷酶的表達情況。4.利用流式細胞術檢測HFF-miR-17與HFF-NC細胞周期的變化情況。利用Western blotting檢測,空白對照細胞HFF、陰性對照細胞HFF-NC和實驗組細胞HFF-miR-17中p21和cyclinDl蛋白表達水平。研究結果：1.采用SABC法對細胞行免疫化學染色,實驗組用兔抗人波形蛋白單克隆抗體作為一抗,顯微鏡下觀察可見,細胞呈長梭形或多角形,細胞胞漿呈棕色染色,提示其為HFF細胞。2. 慢病毒感染HFF 72h后,熒光顯微鏡下檢測到綠色熒光分布于細胞內,與光學顯微鏡下同一視野對比,熒光示感染效率達90%,提示感染成功。慢病毒感染HFF 72h后,利用實時定量PCR技術檢測到感染了Lenti-miR-17的細胞與感染了Lenti-NC的細胞相比,miR-17表達明顯上調,二者差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.通過CCK-8法觀察HFF細胞生長的變化。與陰性細胞HFF-NC相比,穩(wěn)定表達miR-17的HFF-miR-17細胞在450nm處的吸光度值連續(xù)六天均明顯升高,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),表明miR-17能夠促進HFF細胞的增殖能力。4.對細胞進行衰老相關p-半乳糖苷酶染色,HFF-miR-17細胞顯示出較弱的衰老相關p-半乳糖苷酶染色,不到1%的細胞被染成藍色,提示此時細胞為正常細胞；而對照細胞HFF-NC中有高達20%的細胞被染成藍色,表明細胞已衰老,提示miR-17的表達顯著抑制了細胞的衰老。5.利用流式細胞術檢測細胞周期,結果顯示HFF-miR-17細胞與對照HFF-NC相比,停滯在G1期的細胞明顯減少(81.5% vs 72.6%)；用DNA破壞物質Bleomycin處理細胞后,72.9%的HFF-NC細胞停滯在G1期,僅有2.5%的HFF-NC細胞能夠越過G1期進入S期,而HFF-miR-17細胞停滯在G1期的比例顯著減少(54.6%),進入S期的增多(10.2%),說明miR-17促進細胞進入S期進行增殖且能越過藥物誘導的G1 arrest。另外所有流式結果圖中均沒有出現(xiàn)凋亡峰,說明miR-17不是通過抑制細胞的凋亡促進細胞增殖的。6. Western blotting檢測顯示,與空白對照HFF細胞和陰性對照細胞HFF-NC相比,p21蛋白表達水平在HFF-miR-17中下調,而cyclinD1蛋白表達水平顯著升高,說明miR-17能夠通過調控p21和cyclinD1蛋白表達水平,促進原代細胞的增殖,抑制原代細胞的衰老。研究結論：1.利用Dispase Ⅱ酶消化的方法能獲得較高純度的HFF,并首次用慢病毒感染系統(tǒng)成功構建了在人包皮成纖維細胞中穩(wěn)定表達miR-17的細胞系。2.miR-17能夠抑制HFF細胞的衰老。3.miR-17能夠促使HFF由G1期進入S期,促進細胞的增殖。4.miR-17能夠調控HFF中p21和cyclinD1蛋白表達水平,促進原代細胞的增殖,抑制原代細胞的衰老。
【關鍵詞】：人包皮成纖維細胞 衰老 miR-17 細胞周期 p21
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-15
• 前言15-21
• 材料21-27
• 方法27-37
• 結果37-40
• 討論40-44
• 結論44-45
• 附圖45-51
• 參考文獻51-59
• 致謝59-60
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文60-61
• 附件61

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1 魯揮,何憲平;衰老的研究與進展[J];中等醫(yī)學教育;2000年S1期

2 張波,劉承蕓,孟紫強;復制衰老的分子生物學進展[J];生命科學研究;2002年S1期

3 肖政華;張光奇;;衰老的分子基因水平研究[J];貴陽中醫(yī)學院學報;2006年03期

4 楊發(fā)亮;房冬梅;鄒銀平;;淺析運動延緩衰老的機制[J];內江科技;2011年10期

5 王福龍;王甄真;陳雁;;衰老的分子機制與干預研究的最新進展[J];中國細胞生物學學報;2012年08期

6 孫明德;鄭集;;衰老的起因和機制[J];生理科學進展;1981年02期

7 吳鏡海;;人類生理衰老生物學[J];海南大學學報(自然科學版);1985年03期

8 Roy A K;汪義和;;各種衰老理論的評價[J];國外醫(yī)學(老年醫(yī)學分冊);1986年04期

9 陳禮湘;老年生理(1)[J];護士進修雜志;1992年01期

10 劉俊達;衰老和老年病的分子機理[J];老年學雜志;1993年06期

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1 朱漢民;;衰老的生物指標[A];中國營養(yǎng)學會第三屆老年營養(yǎng)暨第二屆營養(yǎng)與腫瘤學術會議論文摘要匯編[C];1994年

2 傅文慶;;衰老及其治療[A];老齡問題研究論文集（七）[C];2005年

3 童坦君;張宗玉;王文恭;;衰老相關基因研究進展[A];老齡問題研究論文集（十一）——積極老齡化研究之三[C];2006年

4 任利群;;衰老與心血管疾病[A];第十屆全國老年醫(yī)學進展學術會議暨江蘇省中西醫(yī)結合學會老年分會學術交流會論文集[C];2010年

5 姚軍孝;毛忠南;王建文;汪海燕;毛立亞;張曉凌;張恩育;;中醫(yī)對衰老的認識和中醫(yī)藥抗衰老機制研究[A];甘肅省中醫(yī)藥學會2013年學術年會論文集[C];2013年

6 彭小冬;張宗玉;童坦君;;衰老相關p21~(WAF1)的高表達并非與p53無關[A];中國生物化學與分子生物學會第八屆會員代表大會暨全國學術會議論文摘要集[C];2001年

7 姚軍孝;毛忠南;王建文;汪海燕;毛立亞;張曉凌;張恩育;;中醫(yī)對衰老的認識和中醫(yī)藥抗衰老機制研究[A];全國針灸臨床適宜技術推廣研討會暨甘肅省針灸學會2013年學術年會論文集[C];2013年

8 姜明紅;項洋;張亞璽;劉士廉;劉彥信;鄭德先;;miRNA在免疫衰老中的調控機制研究[A];遺傳學與社會可持續(xù)發(fā)展——2010中國青年遺傳學家論壇論文摘要匯編[C];2010年

9 呂曉鳳;蔣曉剛;白俊海;毛澤斌;;IGFBP-3基因在衰老細胞中的表達調控研究[A];第七屆全國老年醫(yī)學學術會議暨海內外華人老年醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2004年

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本文編號：398324