本文關(guān)鍵詞：重組融合蛋白TAT-p53對乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙肝病毒,一個(gè)主要的嗜肝DNA病毒,引起全球大約3.5億人慢性感染,在我國有9300萬慢性乙肝患者。在HBV感染肝細(xì)胞的過程中,閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)有效編碼病毒蛋白,事實(shí)上,在HBV感染的病人患者體內(nèi),大量的HBsAg蛋白是通過病毒的cccDNA為模版進(jìn)行合成的,其在血液中的濃度可以達(dá)到105 IU/mL。此外,我們和他人最近的研究結(jié)果表明,HBV的mRNA本身即可增強(qiáng)病毒的表達(dá)和復(fù)制,引起病毒持續(xù)性感染,并且通過miRNA所介導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)HCC的發(fā)展。然而,當(dāng)前的抗HBV藥物發(fā)揮抗病毒活性主要通過抑制前基因組RNA形成HBV DNA的逆轉(zhuǎn)錄過程；或增強(qiáng)細(xì)胞的免疫應(yīng)答,這些抗病毒藥物并不能對病毒的mRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)產(chǎn)生直接的影響,因此有必要研究針對病毒的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)設(shè)計(jì)有效的抗病毒藥物。HBV的轉(zhuǎn)錄由4個(gè)啟動(dòng)子(分別為pre-C/pregenomic, S1, S2和X啟動(dòng)子)所控制,兩個(gè)增強(qiáng)子(增強(qiáng)子I和增強(qiáng)子II)在病毒基因轉(zhuǎn)錄中起到了重要作用。我們以前的研究結(jié)果表明,p53與HBV增強(qiáng)子的R-S元件相結(jié)合,并能顯著抑制病毒啟動(dòng)子／增強(qiáng)子的活性。本研究的目的是設(shè)計(jì)和表達(dá)能抑制病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的重組p53蛋白,為研發(fā)新型抗乙肝病毒藥物提供基礎(chǔ)。首先設(shè)計(jì)細(xì)胞穿膜肽TAT (trans-activator of transcription)與p53融合的表達(dá)載體,在E.coli中成功表達(dá)重組融合蛋白。通過免疫熒光、Western blot和熒光報(bào)告基因檢測證明通過穿膜肽TAT的介導(dǎo),有效引導(dǎo)p53蛋白進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)。接著研究TAT-p53的抗病毒功能,發(fā)現(xiàn)TAT-p53顯著抑制HBV HBsAg和HBeAg的表達(dá),使用TAT-p53處理可使HepG2.2.1.5細(xì)胞的HBsAg表達(dá)量下降3倍左右,同時(shí)real-time PCR、 Southern blot檢測顯示TAT-p53使病毒的轉(zhuǎn)錄水平和復(fù)制水平顯著降低(P0.05或0.01)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)TAT-p53直接抑制病毒Enhancer Ⅰ/Ⅱ的活性,尤為重要的是可逆轉(zhuǎn)病毒本身對Enhancer Ⅰ/Ⅱ的活化,CHIP檢測表明TAT-p53與病毒結(jié)合,表明TAT-p53通過與病毒的增強(qiáng)子區(qū)域相互作用,從而有效地抑制HBV的轉(zhuǎn)錄和抗原的表達(dá)�，F(xiàn)在,已被批準(zhǔn)能治療慢性乙型肝炎的抗病毒藥包括a干擾素(IFN-a),以及核苷酸和核苷酸類似物(NA)。核苷酸類似物主要是抑制pgRNA逆轉(zhuǎn)錄為HBVDNA發(fā)揮抗病毒功能。然而,長期使用NA容易產(chǎn)生耐藥性是制約其發(fā)展的缺點(diǎn)。進(jìn)一步對TAT-p53的抗病毒功能與普遍使用的抗HBV藥物拉米夫定進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)二者均能有效抑制病毒復(fù)制,但TAT-p53對病毒蛋白表達(dá)(HBsAg和HBeAg)有明顯的抑制作用,而拉米夫定并不能明顯影響病毒蛋白的表達(dá)。最后,通過HBV轉(zhuǎn)基因鼠試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TAT-p53有效抑制病毒的表達(dá)與復(fù)制,小鼠注射重組蛋白后HBsAg下降2-3倍,病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制水平下降10倍以上,免疫組化結(jié)果顯示肝臟中近70%的病毒被清除,顯示TAT-p53具有強(qiáng)大的抗病毒活性。綜上所述,本論文成功表達(dá)TAT-p53重組蛋白,通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、HBV轉(zhuǎn)基因鼠實(shí)驗(yàn)證明TAT-p53通過結(jié)合和抑制病毒Enhancer活性,顯著降低病毒的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和復(fù)制,具有強(qiáng)大的抗病毒功能。和現(xiàn)有治療病毒藥(如拉米夫定)不同,TAT-p53能有效抑制病毒1mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),鑒于在乙肝感染中HBV病毒蛋白和mRNA在免疫耐受和病毒持續(xù)性感染中發(fā)揮重要作用,TAT-p53獨(dú)特的抗病毒功能使得它有望開發(fā)成為一種新型的抗病毒藥物,我們的研究結(jié)果為抗HBV感染提供了新的治療途徑。
【關(guān)鍵詞】：p53 乙肝病毒 HBsAg 增強(qiáng)子 TAT-p53 抗病毒
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R373.21
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文縮寫詞表7-11
• 前言11-19
• 第一部分 p53蛋白研究概況11-13
• 1. p53簡介11
• 2. p53分子結(jié)構(gòu)11-12
• 3. p53蛋白生物功能12-13
• 4. p53與HBV作用13
• 第二部分 穿膜肽TAT的分子結(jié)構(gòu)和功能研究13-15
• 1. 穿膜肽簡介13-14
• 2. TAT的分子結(jié)構(gòu)14-15
• 3. TAT功能應(yīng)用15
• 第三部分 乙型肝炎病毒HBV研究概況15-19
• 1. HBV簡介15-16
• 2. HBV的病毒特征16-17
• 3. HBV的復(fù)制17-18
• 4. HBV的治療策略18-19
• 材料和方法19-41
• 第一部分 實(shí)驗(yàn)材料19-24
• 1. 質(zhì)粒及細(xì)胞系19
• 2. PCR引物19-20
• 3. 主要試劑及試劑盒20
• 4. 實(shí)驗(yàn)儀器20-21
• 5. 相關(guān)溶液的配制方法21-24
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)方法24-39
• 1. 質(zhì)粒構(gòu)建24-25
• 2. 細(xì)胞培養(yǎng)25
• 3. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染25-26
• 4. ELISA實(shí)驗(yàn)26
• 5. Western blotting檢測蛋白的表達(dá)水平26-28
• 6. 染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)28-30
• 7. 亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組提30-31
• 8. Daul-Luciferase報(bào)告基因監(jiān)測系統(tǒng)31-32
• 9. 免疫組化32-33
• 10. 胞內(nèi)免疫熒光染色33
• 11. 提取培養(yǎng)上清總DNA和熒光定量PCR33-34
• 12. CCK-8檢測細(xì)胞增殖34-35
• 13. Southern blotting檢測DNA的復(fù)制水平35-37
• 14. TAT-GST融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化和純化37
• 15. 包涵體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化37-38
• 16. 內(nèi)毒素的去除與檢測38-39
• 17. 小鼠實(shí)驗(yàn)39
• 第三部分 統(tǒng)計(jì)分析39-41
• 結(jié)果41-53
• 1、蛋白的表達(dá)純化41-42
• 2、TAT介導(dǎo)重組的TAT-p53進(jìn)入細(xì)胞42-44
• 3、TAT-p53抑制HBV的表達(dá)和復(fù)制的劑量選擇44-46
• 4、TAT-p53抑制HBV的機(jī)制研究46-48
• 5、TAT-p53抑制HBsAg的產(chǎn)生48-50
• 6、TAT-p53在HBV轉(zhuǎn)基因鼠中對HBV表達(dá)和復(fù)制的抑制作用50-53
• 討論53-55
• 結(jié)論55-57
• 主要參考文獻(xiàn)57-63
• 攻讀學(xué)位期間成果63-65
• 致謝65

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本文編號：397442