本文關(guān)鍵詞：HNF1A和FOXA2過表達(dá)誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為肝樣細(xì)胞的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來研究人員發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新、高度可塑、免疫調(diào)節(jié)的性質(zhì),在體外易于分離和擴(kuò)大培養(yǎng),外源基因容易在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入和表達(dá),具有跨胚層、向多種細(xì)胞分化的潛能等特點(diǎn)。其中誘導(dǎo)其分化為肝樣細(xì)胞越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注,間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化得到的肝樣細(xì)胞為肝病治療以及藥物篩選提供了新的種子細(xì)胞。本研究選用FOXA2和HNF1A作誘導(dǎo)基因,通過慢病毒介導(dǎo)的方法將FOXA2和HNF1A同時(shí)在BMSCs中過表達(dá)。發(fā)現(xiàn)從侵染后第5天起,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,挑選出紅色熒光蛋白表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)有變化、長(zhǎng)成集落的細(xì)胞團(tuán)。然后通過篩選得到兩個(gè)外源基因都穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆,通過RT-PCR檢測(cè)表明,上述細(xì)胞中肝細(xì)胞標(biāo)記基因FOXA3、HNF4A、AFP、ALB、TAT、TTR、G6P、CYP1A1和CYP2B1等的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物呈陽性,而對(duì)照組BMSCs呈陰性;誘導(dǎo)后細(xì)胞的干性基因OCT4和NANOG表達(dá)呈陰性。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)表明,上述誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)AFP、ALB、G6P、CK18、TTR和TAT等肝細(xì)胞標(biāo)記蛋白。Western blot檢測(cè)表明,上述細(xì)胞的肝細(xì)胞相關(guān)蛋白ALB、G6P、TAT、TTR、CK18、AFP等特異性顯色,而對(duì)照細(xì)胞BM-MSCs呈陰性。綜上檢測(cè)結(jié)果表明,被FOXA2和HNF1A過表達(dá)誘導(dǎo)的BMSCs具有肝細(xì)胞的分子特征。為了進(jìn)一步驗(yàn)證誘導(dǎo)細(xì)胞的功能,本論文又采用PAS糖原染色、ICG攝入檢測(cè)和油紅O脂肪染色等方法來檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞是否具有肝細(xì)胞的功能。結(jié)果表明,與對(duì)照組BMSCs相比,誘導(dǎo)細(xì)胞具有與類似肝細(xì)胞糖原儲(chǔ)存能力、ICG代謝能力和脂肪儲(chǔ)存能力。此結(jié)果進(jìn)一步說明了FOXA2和HNF1A過表達(dá)能誘導(dǎo)BMSCs分化為肝樣細(xì)胞。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功地通過一對(duì)新的轉(zhuǎn)錄因子組合定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成肝樣細(xì)胞,同時(shí)還具有節(jié)省誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)效率較高等優(yōu)點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 叉頭框蛋白A2(FOXA2) 肝細(xì)胞核因子1(HNF1A) 細(xì)胞定向分化 肝樣細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 縮略語表10-12
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述12-28
• 1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展13-16
• 1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定13-14
• 1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能14-15
• 1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用前景和挑戰(zhàn)15-16
• 2 影響干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞的因素16-23
• 2.1 通過細(xì)胞因子作用獲得肝樣細(xì)胞17-18
• 2.2 通過化合物誘導(dǎo)獲得肝樣細(xì)胞18
• 2.3 通過基因修飾誘導(dǎo)獲得肝樣細(xì)胞18-19
• 2.4 通過細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得肝樣細(xì)胞19-20
• 2.5 其它誘導(dǎo)獲得肝樣細(xì)胞方法20-22
• 2.6 誘導(dǎo)后細(xì)胞的鑒定及檢測(cè)22
• 2.7 從成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞獲得的肝樣細(xì)胞性質(zhì)比較22-23
• 2.8 問題和展望23
• 3 HNF1A和FOXA2功能及其作用23-27
• 3.1 HNF1A的結(jié)構(gòu)和功能23-25
• 3.2 FOXA2的結(jié)構(gòu)和功能25-27
• 4 本研究的目的和意義27-28
• 4.1 研究目的27
• 4.2 研究意義27-28
• 第二部分 材料和方法28-49
• 1 實(shí)驗(yàn)材料28-32
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞及質(zhì)粒28
• 1.2 主要試劑及溶液配制28-31
• 1.3 實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備31
• 1.4 主要耗材31-32
• 2 試驗(yàn)方法32-49
• 2.1 構(gòu)建兩種重組慢病毒載體32-33
• 2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和凍存33-34
• 2.3 鼠尾膠原的制備及使用34-35
• 2.4 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)35-36
• 2.5 目的基因慢病毒的包裝及檢測(cè)36-39
• 2.6 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的侵染和誘導(dǎo)39-41
• 2.7 誘導(dǎo)后細(xì)胞的檢測(cè)41-49
• 第三部分 結(jié)果和討論49-66
• 1 兩種重組慢病毒載體構(gòu)建結(jié)果49-50
• 2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果50-52
• 2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)結(jié)果50-51
• 2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定結(jié)果51-52
• 3 兩種重組慢病毒的制備結(jié)果52-53
• 4 制備的重組慢病毒滴度檢測(cè)結(jié)果53-54
• 5 慢病毒侵染BMSCS及其形態(tài)變化54-57
• 6 誘導(dǎo)細(xì)胞基因和蛋白表達(dá)變化57-60
• 6.1 誘導(dǎo)細(xì)胞的基因表達(dá)變化57-58
• 6.2 誘導(dǎo)細(xì)胞的蛋白表達(dá)變化58-60
• 7 誘導(dǎo)細(xì)胞功能檢測(cè)結(jié)果60-62
• 7.1 糖原PAS染色結(jié)果60
• 7.2 ICG攝入檢測(cè)結(jié)果60-61
• 7.3 油紅O脂肪染色結(jié)果61-62
• 8 小結(jié)62
• 9 討論62-66
• 結(jié)論66-68
• 參考文獻(xiàn)68-78
• 致謝78-80
• 攻讀碩士學(xué)位期間參加的科研項(xiàng)目和發(fā)表的論文80-81

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