本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌可塑區(qū)hpsh0459基因生物學功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:幽門螺桿菌(H.pylori)Hpsh0459蛋白由位于H.pylori可塑區(qū)(TnPZ)中的hpsh0459基因編碼,有研究認為該基因的編碼產(chǎn)物可以與H.pylori TnPZ中的其他基因(virB4,virB8,virB9,virB11,virD4和virD2)編碼產(chǎn)物共同構(gòu)成一個新的IV型分泌系統(tǒng)(tfs3a)。目前國內(nèi)外尚缺乏對hpsh0459基因及其編碼產(chǎn)物Hpsh0459的功能及相關(guān)致病機制的研究報道。本文以H.pylori臨床分離菌株WH-21為研究對象,通過分子生物學、生物信息學和免疫學等技術(shù)手段對hpsh0459基因及其編碼產(chǎn)物Hpsh0459的功能進行了探究,為深入研究其在H.pylori致病機制中的地位及作用奠定了基礎(chǔ)。方法:1.將H.pylori WH-21菌株于微需氧環(huán)境中在Karmali培養(yǎng)基上培養(yǎng),采用PCR手段,以H.pylori WH-21菌株基因組為模板,用特異性引物擴增hpsh0459基因片段,經(jīng)測序后得到核酸序列,并推導出編碼氨基酸序列。采用生物信息學,分析hpsh0459基因推導蛋白的基本理化性質(zhì)、細胞定位、信號肽及空間結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息;2.構(gòu)建hpsh0459基因的原核表達載體,轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG誘導宿主表達融合蛋白Hpsh0459。用Ni2+-NTA親和層析柱對融合蛋白進行純化,并采用Western blot對其所攜帶的His標簽進行鑒定。以純化后的Hpsh0459為抗原,通過免疫家兔制備抗-Hpsh0459多克隆抗體,抗體效價通過ELISA方法測定;3.將不同濃度的純化Hpsh0459蛋白與人正常胃上皮細胞GES-1進行共培養(yǎng),用MTT方法研究其細胞毒性。將共培養(yǎng)后的上清培養(yǎng)液收集,用IL-8檢測試劑盒(elisa)法檢測其中的il-8含量;4.采用低溫超速離心法將h.pyloriwh-21菌株的菌體成分裂解為不同的亞細胞組分,以兔抗hpsh0459多克隆抗體為一抗,以免疫印跡法對hpsh0459的亞細胞定位進行檢測。用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析的手段,探究hpsh0459的互作蛋白;5.構(gòu)建hpsh0459基因敲除載體,用于建立hpsh0459的基因缺失株。結(jié)果:1.以h.pyloriwh-21菌株為模板,成功獲得了長度為1233bp的hpsh0459基因全長片段。生物信息學分析顯示,該基因可編碼分子量為46.31kda的蛋白質(zhì),該蛋白由411個氨基組成。該蛋白的等電點為9.45,屬于無信號肽的親水性穩(wěn)定蛋白,其抗原位點聚集于c端,空間結(jié)構(gòu)呈通道狀,提示hpsh0459蛋白可能參與細胞生物大分子的轉(zhuǎn)運。2.構(gòu)建了hpsh0459基因的原核表達載體pet28a-hpsh0459(633bp),經(jīng)誘導純化后獲得了高純度的hpsh0459的c端蛋白。通過免疫家兔,獲得了效價為1:32,000的兔抗-hpsh0459多克隆抗體。3.hpsh0459蛋白與ges-1共培養(yǎng)后,通過mtt實驗和elisa法對hpsh0459蛋白的細胞毒性和上清液il-8含量進行了分析。結(jié)果表明hpsh0459蛋白的細胞毒性有濃度依賴性,hpsh0459濃度為0.1μg/ml時的細胞抑制率明顯低于hpsh0459濃度為20μg/ml時的細胞抑制率(3.02%±0.02%vs57.57%±0.03%,p0.01)。隨共培養(yǎng)時間的延長,24h(1316.31±212.78pg/ml)和12h(1043.44±210.88pg/ml)的il-8水平明顯高于共培養(yǎng)6h的il-8水平(97.22±11.47pg/ml,p0.01)。表明該蛋白能明顯刺激細胞il-8的分泌,與宿主炎癥反應的發(fā)生有關(guān)。4.以兔抗-hpsh0459多克隆抗體為一抗,分別采用免疫印跡法和免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析的方法明確了hpsh0459蛋白的亞細胞定位及互作蛋白。結(jié)果表明,hpsh0459定位于細胞膜和細胞周質(zhì)上,與鋅指蛋白和蛋氨酸轉(zhuǎn)運atp結(jié)合蛋白等存在相互作用。5.成功構(gòu)建了hpsh0459基因的敲除載體pbluekm40-?hpsh0459::kan。結(jié)論:1.通過信息分析,明確了hpsh0459是一種高親水性的穩(wěn)定性蛋白,有較強的抗原性,該蛋白與virb10、trbi家族蛋白具有較高的同源性。其空間結(jié)構(gòu)呈中空的通道狀,可能與周邊的其他virB基因組成一個新的T4SS。2.通過構(gòu)建hpsh0459原核表達載體pET-28a-hpsh0459(633bp),獲得了目的蛋白和高效價的兔源Hpsh0459多克隆抗體。3.明確了該蛋白與鋅指蛋白和蛋氨酸轉(zhuǎn)運ATP結(jié)合蛋白等蛋白存在相互作用,可能與H.pylori的DNA轉(zhuǎn)運有關(guān)。4.明確了Hpsh0459是一種定位于細菌細胞膜和膜周質(zhì)中的有濃度依賴性細胞毒作用的蛋白。能刺激細胞IL-8的分泌,與組織炎癥的發(fā)生有關(guān);5.成功構(gòu)建了hpsh0459基因敲除載體pBlueKM40-?hpsh0459::kan。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 可塑區(qū) hpsh0459 生物學功能 IL-8
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 中文摘要10-13
• 英文摘要13-16
• 前言16-23
• 參考文獻20-23
• 第一部分 H. pylori hpsh0459基因克隆表達及多克隆抗體制備23-54
• （二） 材料和方法23-37
• 1 材料23-29
• 1.1 實驗菌株和載體23-24
• 1.2 主要試劑24-25
• 1.3 主要溶液的配制25-28
• 1.4 主要儀器28-29
• 2 方法29-37
• 2.1 H. pylori的培養(yǎng)與鑒定29
• 2.2 H. pylori DNA的提取29-30
• 2.3 H. pylori hpsh0459基因的引物設(shè)計與PCR反應30
• 2.4 PCR產(chǎn)物的膠回收30-31
• 2.5 感受態(tài)細菌細胞DH5α 的制備31
• 2.6 hpsh0459基因的T-A連接反應31
• 2.7 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細菌及轉(zhuǎn)化子的驗證31-32
• 2.8 hpsh0459重組質(zhì)粒的提取32
• 2.9 hpsh0459基因推導編碼產(chǎn)物的獲得32
• 2.10 H. pylori Hpsh0459蛋白的生物信息學分析32-33
• 2.11 hpsh0459重組原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定33-34
• 2.12 融合蛋白的誘導表達34-35
• 2.13 重組Hpsh0459蛋白的大量表達和純化35
• 2.14 純化重組Hpsh0459蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析35-36
• 2.15 重組Hpsh0459蛋白的多克隆抗體制備及其效價測定36-37
• （三） 結(jié)果37-49
• 1 H. pylori hpsh0459基因片段的克隆及生物信息學分析37-45
• 1.1 H. pylori WH-21菌株的分離培養(yǎng)與鑒定鑒定37-38
• 1.2 H. pylori hpsh0459基因片段的PCR擴增38-39
• 1.3 hpsh0459基因的克隆與鑒定39
• 1.4 Hpsh0459的基本性質(zhì)分析39-41
• 1.5 Hpsh0459蛋白信號肽和跨膜區(qū)的預測41-42
• 1.6 Hpsh0459蛋白二級結(jié)構(gòu)預測42-43
• 1.7 Hpsh0459卷曲螺旋的預測分析43-44
• 1.8 Hpsh0459蛋白三維結(jié)構(gòu)的預測44
• 1.9 Hpsh0459蛋白功能結(jié)構(gòu)域的預測44-45
• 2 H. pylori hpsh0459基因的原核表達及抗體制備45-49
• 2.1 hpsh0459(1233bp)及hpsh0459(633bp)基因片段PCR擴增克隆及鑒定序列分析45-47
• 2.2 重組表達質(zhì)粒pET28a-hpsh0459的構(gòu)建及序列分析47
• 2.3 重組蛋白的誘導表達及鑒定47-48
• 2.4 重組蛋白的純化與抗體效價測定48-49
• （四） 討論49-50
• （五） 結(jié)論50-51
• （六） 參考文獻51-54
• 第二部分H. pylori Hpsh0459蛋白的亞細胞定位及其互作蛋白和細胞毒性分析54-67
• （二） 材料和方法54-59
• 1 材料54-56
• 1.1 菌株及細胞株54
• 1.2 主要試劑54-55
• 1.3 主要溶液配制55-56
• 1.4 主要儀器56
• 2 方法56-59
• 2.1 H. pylori分離組分和亞細胞定位56-57
• 2.2 Hpsh0459蛋白的互作蛋白分析57
• 2.3 免疫共沉淀中Hpsh0459蛋白的驗證57-58
• 2.4 細胞的復蘇與培養(yǎng)58
• 2.5 Hpsh0459蛋白與GES-1 細胞共培養(yǎng)及MTT實驗58
• 2.6 Hpsh0459蛋白與GES-1 細胞共培養(yǎng)上清液IL-8 濃度分析58
• 2.7 統(tǒng)計學分析58-59
• （三）結(jié)果59-62
• 1 Hpsh0459蛋白的亞細胞定位及互作蛋白分析59-60
• 1.1 Hpsh0459蛋白的亞細胞定位59
• 1.2 Hpsh0459蛋白的互作蛋白分析59-60
• 2 Hpsh0459蛋白的細胞毒性分析60-62
• 2.1 Hpsh0459蛋白與GES-1 細胞共培養(yǎng)及MTT分析60-61
• 2.2 Hpsh0459蛋白與GES-1 細胞共培養(yǎng)上清液IL-8 濃度分析61-62
• （四）討論62-63
• （五）結(jié)論63-64
• （六）參考文獻64-67
• 第三部分H. pylori hpsh0459基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建67-73
• （二）材料和方法67-69
• 1 材料67
• 1.1 菌株與載體67
• 2 方法67-69
• 2.1 hpsh0459基因上下游同源臂的擴增67-68
• 2.2 重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定68-69
• （三）結(jié)果69-70
• 1.1 hpsh0459基因上下游同源臂的PCR擴增69-70
• 1.2 hpsh0459基因缺陷重組自殺質(zhì)粒的構(gòu)建70
• 討論70-71
• 結(jié)論71
• 參考文獻71-73
• 綜述73-81
• 參考文獻78-81
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況81-82
• 致謝82-83

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 谷鈺峰;幽門螺桿菌可塑區(qū)hpsh0459基因生物學功能研究[D];大連醫(yī)科大學;2015年

  本文關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌可塑區(qū)hpsh0459基因生物學功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：393068