綠色熒光蛋白作為一種新型的標(biāo)記分子，可應(yīng)用于活體細(xì)胞的實(shí)時(shí)檢測。目前已有相當(dāng)多的文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于將GFP基因與特定抗體或細(xì)胞因子基因結(jié)合進(jìn)行融合表達(dá)的研究，證明融合蛋白具有GFP的熒光性質(zhì)和配體蛋白質(zhì)的生物功能，可用于對腫瘤的檢測、藥物篩選、細(xì)胞因子受體的分布以及功能等方面的研究，應(yīng)用前景廣闊。 目前國內(nèi)關(guān)于將綠色熒光蛋白與其他細(xì)胞因子融合表達(dá)的報(bào)道較少。相關(guān)的報(bào)道有抗肝癌單鏈抗體融合GFP在真核細(xì)胞中的表達(dá)，以及重組IL-18-GFP融合蛋白活性研究等。本論文擬將抗肺癌單鏈抗體連接綠色熒光蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，預(yù)期目標(biāo)蛋白應(yīng)同時(shí)具有抗體活性及光激發(fā)綠色熒光雙重功能。 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)PCR方法從mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中克隆到抗肺癌抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，并利用重疊延伸PCR方法將其構(gòu)建為單鏈抗體scfv形式。利用酶切連接將scfv基因序列插入到綠色熒光蛋白基因3’-端構(gòu)成gfp-scfv重組基因，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后并SDS-PAGE蛋白電泳，與陰性菌對照，在預(yù)期分子量范圍內(nèi)出現(xiàn)一明顯條帶。利用Ni-NTA樹脂純化蛋白，出現(xiàn)兩個(gè)明顯的峰。SDS-PAGE電泳分析...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一部分 綠色熒光蛋白研究進(jìn)展
    前言
    1 、 綠色熒光蛋白的理化性質(zhì)
    2 、 綠色熒光蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)和發(fā)光機(jī)制
        2.1 綠色熒光蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)
        2.2 野生型綠色熒光蛋白的發(fā)光機(jī)制
        2.3 突變型GFP的發(fā)光機(jī)制
            2.3.1 Ⅰ型突變
            2.3.2 Ⅱ型突變
            2.3.3 Ⅲ型突變
    3 、 綠色熒光蛋白在生物技術(shù)中的應(yīng)用
        3.1 分子標(biāo)記
            3.1.1 基因表達(dá)的報(bào)告
            3.1.2 在細(xì)胞生物學(xué)中作為熒光標(biāo)記用于細(xì)胞動(dòng)態(tài)的研究
            3.1.3 活細(xì)胞內(nèi)蛋白的定位研究
        3.2 GFP在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的應(yīng)用
        3.3 藥物篩選
        3.4 融合抗體
        3.5 生物傳感器
    4 、 展望
    參考文獻(xiàn)
第二部分 抗肺癌單鏈抗體偶聯(lián)綠色熒光蛋白基因的構(gòu)建及表達(dá)研究
    前言
    1 、 實(shí)驗(yàn)材料和儀器
        1.1 菌種及質(zhì)粒
        1.2 酶
        1.3 各種試劑盒
        1.4 緩沖液及其他溶液
        1.5 培養(yǎng)液和固體培養(yǎng)基
        1.6 其它主要試劑和商品來源
        1.7 電泳膠
        1.8 PCR引物
        1.9 主要儀器
    2 、 方法
    3 、 結(jié)果
        3.1 抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的克隆
        3.2 重鏈和輕鏈的序列測定
        3.3 VL基因的修飾
        3.4 單鏈抗體的構(gòu)建
        3.5 Pro319質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.6 gfp-scfv基因構(gòu)建
        3.7 gfp-scfv基因在大腸桿菌的表達(dá)
    4 、 討論
    參考文獻(xiàn)
附錄1 Pava319質(zhì)粒序列
附錄2 英文縮寫詞表
致謝



本文編號(hào)：3899722