本文關(guān)鍵詞：HIV-1 Tat與DNA-PKcs相互作用及采用TALEN與CRISPR敲除細(xì)胞Tip60的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：HIV-1 Tat蛋白是一個(gè)由HIV-1編碼的調(diào)控蛋白,對(duì)于HIV病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制具有至關(guān)重要的作用。Tat蛋白可以和宿主細(xì)胞內(nèi)多種蛋白發(fā)生相互作用促進(jìn)HIV病毒轉(zhuǎn)錄,并通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡破壞宿主免疫系統(tǒng)。此外,Tat可以作為一個(gè)旁分泌分子由受感染細(xì)胞分泌進(jìn)入未受感染細(xì)胞進(jìn)而增加其感染風(fēng)險(xiǎn)。DNA-PKcs是DNA依賴的蛋白激酶復(fù)合物DNA-PK的主要催化亞基,屬于磷脂酰肌醇3-激酶超家族(P13K),在DNA損傷后非同源末端修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。DNA損傷發(fā)生后,DNA-PKcs通過Ku蛋白轉(zhuǎn)移到DNA損傷末端,從而被DNA末端激活啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。不僅如此,DNA-PKcs在V(D)J重組、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡與自吞噬過程中均發(fā)揮重要作用。在此之前我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Tat能夠抑制DNA-PKcs的表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感度,并且能夠通過與Plk-1、Cyclin B、Tip60相互作用影響細(xì)胞周期變化。此外我們組還證實(shí)HIV-1 Tat能夠直接結(jié)合DNA-PKcs的核心啟動(dòng)子序列參與其表達(dá)下調(diào),并首次將DNA-PKcs核心啟動(dòng)子區(qū)域由先前報(bào)道的-106～-3縮短至-63--1。并發(fā)現(xiàn)HIV-1 Tat可以直接激活DNA-PKcs激酶活性,其活性水平與Tat蛋白成劑量依賴關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)行了進(jìn)一步研究,取得的主要科研進(jìn)展有：1.通過免疫共沉淀與GST-pull down實(shí)驗(yàn),我們進(jìn)一步證實(shí)了HIV-1 Tat可以直接與DNA-PKcs發(fā)生相互作用,同時(shí)無論內(nèi)源還是外源Tat蛋白,都能夠明顯增強(qiáng)DNA-PKcs的S2056位點(diǎn)磷酸化水平。2.既然DNA-PKcs作為類別轉(zhuǎn)換重組(CSR)的重要組成部分,為探索這一機(jī)制我們對(duì)Tat蛋白在CSR過程中的作用進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示低濃度(4μg/ml)的Tat蛋白能夠有效抑制類別轉(zhuǎn)換重組的發(fā)生,而高濃度(8μg/ml)時(shí)則會(huì)刺激CSR的發(fā)生。3.既然Tat可以與DNA-PKcs相互作用并調(diào)控其活性,那么DNA-PKcs是否也可以通過Tat參與調(diào)控HIV-1轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示低水平且具有活性的DNA-PKcs對(duì)于HIV-1的轉(zhuǎn)錄是必不可少的,而DNA-PKcs在高表達(dá)水平且激酶活性較低時(shí)則能夠明顯抑制HIV-1的轉(zhuǎn)錄。4.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明DNA-PKcs雖能夠與cyclin T1、CDK9、Tat形成一個(gè)巨大的復(fù)合體,但DNA-PKcs僅僅與CDK9和Tat蛋白直接結(jié)合而與cyclin T1并無直接相互作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于未來DNA-PKcs的研究提供了一個(gè)新的方向,對(duì)Tat蛋白在宿主體液免疫中作用的研究提供了新的思路與理論意義。同時(shí)提出了一種的可能性,即是否可以通過對(duì)DNA-PKcs的直接抑制和干預(yù)抑制艾滋病患者體內(nèi)HIV-1的轉(zhuǎn)錄,這對(duì)未來抗HIV治療及其新藥的研制提供了新的策略。Tip60 (Tat interactive protein,60kD)最早是通過酵母雙雜交的方法所鑒定出來的可以與HIV 1-tat相互作用的蛋白,由于其分子量為60kd,故被命名為Tip60。Tip60屬于MYST乙�；D(zhuǎn)移酶家族,主要參與乙�；M蛋白H2A、H3、H4及多種相關(guān)蛋白,調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及下游分子應(yīng)答。大量文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道Tip60可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與核受體及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)一步激活或者抑制下游基因的表達(dá),如雄激素受體、AICD/Fe65、NCoR、c-MYC、E2F等,此外Tip60還可以通過乙�；幌盗械鞍渍{(diào)控其活性與穩(wěn)定性。當(dāng)DNA雙鏈發(fā)生斷裂損傷后,Tip60可以通過乙酰化ATM的K3016位點(diǎn)促進(jìn)ATM發(fā)生自磷酸化進(jìn)而激活下游底物P53、chk2,誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。綜上所述,我們可以看到Tip60在基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、凋亡與自吞噬等方面均發(fā)揮重要調(diào)控作用。此外,Tip60還可以影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,它的失活將會(huì)導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)缺陷及癌癥風(fēng)險(xiǎn)的增加。由于Tip60基因雙位點(diǎn)敲除小鼠會(huì)導(dǎo)致胚胎致死,我們分別采用了當(dāng)前最先進(jìn)的TALEN與CRISPR兩種基因敲除技術(shù)在細(xì)胞水平穩(wěn)定敲除內(nèi)源性Tip60基因,建立能夠穩(wěn)定敲除Tip60基因的細(xì)胞系,為后續(xù)研究Tip60在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、自吞噬調(diào)控中的作用打下基礎(chǔ)。TALEN技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程：首先根據(jù)Tip60基因序列并結(jié)合生物信息學(xué)設(shè)計(jì)多個(gè)靶位點(diǎn)識(shí)別序列；分別根據(jù)識(shí)別序列進(jìn)行TALEN質(zhì)粒對(duì)的構(gòu)建工作；成功構(gòu)建并測(cè)序驗(yàn)證后提取質(zhì)粒；直接采用提取的TALEN質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,并于轉(zhuǎn)染48h后提取多克隆細(xì)胞基因組；采用對(duì)應(yīng)引物PCR擴(kuò)增含有切割位點(diǎn)的基因序列,并于回收后進(jìn)行退火處理,最后采用T7核酸內(nèi)切酶酶切檢測(cè)靶位點(diǎn)是否發(fā)生變化進(jìn)而對(duì)TALEN切割效率進(jìn)行檢測(cè)。接下來選擇具有較高切割效率的TALEN質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞；并于48h后將細(xì)胞稀釋至96孔板培養(yǎng),使每孔理論上只有一個(gè)細(xì)胞；當(dāng)培養(yǎng)約4-5周左右待細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳至12孔板繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)；待其再次長(zhǎng)滿后取部分細(xì)胞提取單克隆細(xì)胞基因組；采用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶片段,并將單克隆細(xì)胞基因組PCR回收產(chǎn)物與野生型細(xì)胞基因組PCR回收產(chǎn)物混合后退火處理；采用T7內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽性單克�。贿x擇陽性片段克隆到T載體,測(cè)序篩選移碼突變細(xì)胞系,篩選Tip60基因穩(wěn)定敲除的細(xì)胞系。CRISPR技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程：CRISPR技術(shù)同樣根據(jù)Tip60基因序列并結(jié)合生物信息學(xué)設(shè)計(jì)多個(gè)靶位點(diǎn)識(shí)別序列并根據(jù)設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)進(jìn)行CRISPR識(shí)別序列的構(gòu)建；待識(shí)別序列構(gòu)建好并測(cè)序驗(yàn)證成功后通過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝為慢病毒；將包裝好的CRISPR慢病毒感染U20S細(xì)胞,感染48h后使用嘌呤霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理,將篩選過的細(xì)胞再次感染Cas9腺病毒后提取細(xì)胞基因組；采用對(duì)應(yīng)引物PCR擴(kuò)增含有切割位點(diǎn)的基因序列并退火處理,最后采用T7核酸內(nèi)切酶酶切檢測(cè)CRISPR切割效率與活性。選擇具有較高切割效率的CRISPR慢病毒感染細(xì)胞48小時(shí)并用puro處理一周后感染腺病毒；將存活細(xì)胞稀釋至96孔板中進(jìn)行培養(yǎng),使每孔理論上只有一個(gè)細(xì)胞；之后篩選工作與TALEN技術(shù)相同,采用T7內(nèi)切酶酶切鑒定篩選出穩(wěn)定敲除Tip60基因的細(xì)胞系。我們采用以上兩種技術(shù)篩選出可以對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行高效切割的TALEN質(zhì)粒對(duì)與CRISPR慢病毒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,最終通過T7內(nèi)切酶酶切檢測(cè)成功篩選出Tip60基因單位點(diǎn)穩(wěn)定敲除的細(xì)胞系。為后續(xù)我們研究Tip60在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、自吞噬中的作用及其詳細(xì)分子機(jī)制打下了很好的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：HIV-1 Tat DNA-PKcs Tip60 TALEN CRISPR 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-17
• 材料與方法17-34
• 結(jié)果34-47
• 討論47-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-55
• 綜述55-62
• 代表性論著62-74
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷74-75
• 在學(xué)期間的研究成果目錄75-76
• 致謝76

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本文編號(hào)：383986