本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌與碳青霉烯類(lèi)耐藥相關(guān)基因PA0667,PA2734基因功能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：銅綠假單胞菌是全球主要的引發(fā)感染的機(jī)會(huì)致病菌之一,特別在免疫力低下的病人如燒傷等極易感染。這種致病菌的另一個(gè)重要特征就是對(duì)目前已知的很多抗生素都有耐藥性,因此給臨床治療帶來(lái)了很大挑戰(zhàn)。碳青霉烯類(lèi)抗生素屬于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的一種,是治療銅綠假單胞菌感染的重要抗生素之一。然而近年來(lái)隨著其在臨床上的廣泛使用,使得銅綠假單胞菌對(duì)該類(lèi)抗生素的耐藥性逐年遞增,因此給臨床治療帶來(lái)了極大的難題。因此對(duì)該類(lèi)抗菌藥物耐受機(jī)理的探索就顯得尤為重要。實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)座突變體庫(kù)的方法用比亞培南,美羅培南,亞胺培南篩選了與碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥相關(guān)的基因。其中PA0667對(duì)這三種抗生素敏感性增加,PA2734對(duì)三種抗生素敏感性降低。本論文在此基礎(chǔ)上對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了敲除突變體的構(gòu)建并對(duì)基因功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究。在所篩選的突變體中,PA0667對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素敏感性增加的倍數(shù)較為明顯。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),突變體PAO1(△0667)相比于野生型對(duì)比亞培南的敏感性增加了4倍,對(duì)美羅和亞胺培南分別增加了2倍和1倍,因此PA0667與碳青霉烯類(lèi)抗生素的敏感性相關(guān)。PAO1(△0667)破壞了外膜的完整性,使小分子物質(zhì)容易進(jìn)入。研究發(fā)現(xiàn)PAO1(A0667)對(duì)于維持穩(wěn)定性有重要影響,因此導(dǎo)致PAO1(△0667)對(duì)抗生素敏感性增加。PA0667為四型基因且功能未知,該基因在大腸桿菌中與蛋白YebA有一定的相似性,該蛋白在大腸桿菌中參與細(xì)胞壁的合成。PAO1(A0667)的生長(zhǎng)基本與野生型PAO1差別不大。氨芐青霉素的加入使PAO1(A0667)和野生型PAO1的生長(zhǎng)與不加該抗生素相比受到抑制。實(shí)驗(yàn)表明,突變體PAO1(△0667)對(duì)四種青霉素結(jié)合蛋白pbpG7,pbp 1 a,pbpB3,pbpA2發(fā)光報(bào)道子的表達(dá)水平與野生型PAO1相比有明顯的降低,進(jìn)一步說(shuō)明了青霉素結(jié)合蛋白在細(xì)胞壁肽聚糖的合成過(guò)程中發(fā)揮著重要影響。PA0667預(yù)測(cè)是一種與金屬內(nèi)肽酶有關(guān)的膜蛋白,有文獻(xiàn)表明,金屬內(nèi)肽酶可能是一種潛在的毒性因子。利用中國(guó)白菜和果蠅為感染模型,以及運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了突變體PAO1(△0667)和PAO1的毒性變化,結(jié)果顯示突變體PAO1(△0667)的毒性與野生型PA01相比明顯增加。表明PA0667涉及銅綠假單胞菌的毒性與致病性。為了進(jìn)一步確證PA0667的功能,對(duì)操縱子PA0666-0667敲除突變體的功能進(jìn)行了初步探索,結(jié)果表明PA0666-0667與耐藥性和致病性均相關(guān)。PA2734在所篩選的基因中對(duì)三種碳青霉烯類(lèi)抗生素抗藥性增加較為明顯,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變體PAO1(△2734)對(duì)比亞培南,美羅培南,亞胺培南的耐藥性分別提高了4倍,2倍和4倍。說(shuō)明PA2734確實(shí)與碳青霉烯類(lèi)抗生素的敏感性相關(guān)。PA2734為功能未知的四型基因,預(yù)測(cè)與限制性?xún)?nèi)切酶的S亞基有關(guān)。研究表明,PA2734的突變會(huì)引起運(yùn)動(dòng)相關(guān)的表達(dá)質(zhì)粒Pi1D,fliC的表達(dá)水平降低,并且Swarming, Swimming和Twicthing三種運(yùn)動(dòng)的表型與野生型PAO1相比明顯降低。突變體粘附性的降低更進(jìn)一步地反應(yīng)了PA2734對(duì)于細(xì)菌定植和擴(kuò)散的重要性。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌 碳青霉烯類(lèi)抗生素 耐藥性 致病性 PA0667 PA2734
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 縮寫(xiě)對(duì)比表12-13
• 第一章 緒論13-23
• 1.1 銅綠假單胞菌和碳青霉烯類(lèi)抗生素13
• 1.1.1 銅綠假單胞菌13
• 1.1.2 碳青霉烯類(lèi)抗生素13
• 1.2 銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥機(jī)制13-15
• 1.3 細(xì)菌的金屬內(nèi)肽酶15
• 1.4 細(xì)菌的細(xì)胞壁15-19
• 1.4.1 細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的結(jié)構(gòu)16
• 1.4.2 革蘭氏陰性細(xì)菌肽聚糖的合成16-17
• 1.4.3 細(xì)胞壁外膜的完整性與穩(wěn)定性17-19
• 1.5 銅綠假單胞菌的致病性19-20
• 1.6 細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)及其分類(lèi)20-21
• 1.7 研究?jī)?nèi)容及意義21-23
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法23-35
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 2.1.1 菌株和質(zhì)粒23
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑24
• 2.1.4 培養(yǎng)基的配置24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-35
• 2.2.1 質(zhì)粒小劑量提取25-26
• 2.2.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備26
• 2.2.3 銅綠假單胞菌感受態(tài)細(xì)胞的制備26-27
• 2.2.4 電轉(zhuǎn)化27
• 2.2.5 酶切和連接27-28
• 2.2.6 瓊脂糖凝膠核酸片段回收純化28
• 2.2.7 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系28
• 2.2.8 基因敲除實(shí)驗(yàn)28-31
• 2.2.9 敲除突變體互補(bǔ)體的構(gòu)建31
• 2.2.10 銅綠假單胞菌最小抑制濃度(MIC)的測(cè)定31
• 2.2.11 抗生素敏感性檢測(cè)31-32
• 2.2.12 在固體和液體培養(yǎng)基上檢測(cè)突變體的生長(zhǎng)情況32
• 2.2.13 外膜穩(wěn)定性和外膜完整性32
• 2.2.14 氨節(jié)青霉素裂解實(shí)驗(yàn)32-33
• 2.2.15 果繩感染實(shí)驗(yàn)33
• 2.2.16 白菜實(shí)驗(yàn)33
• 2.2.17 運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)33-34
• 2.2.18 基因報(bào)道子發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè)34
• 2.2.19 粘附性實(shí)驗(yàn)34-35
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-53
• 3.1 PA0667基因功能的研究35-42
• 3.1.1 PA0667的基本信息35
• 3.1.2 基因PA0667敲除突變體的構(gòu)建35-36
• 3.1.3 敲除突變體互補(bǔ)體的構(gòu)建36
• 3.1.4 抗生素敏感性檢測(cè)36-37
• 3.1.5 PA0667對(duì)外膜結(jié)構(gòu)的影響37-38
• 3.1.6 突變體PAO1(A0667)生長(zhǎng)情況的檢測(cè)38-40
• 3.1.7 突變體在幾種青霉素結(jié)合蛋白中的表達(dá)檢測(cè)40-41
• 3.1.8 氨芐西林(Ampicillin)裂解實(shí)驗(yàn)41-42
• 3.2 PA0667對(duì)銅綠假單胞菌致病性的影響42-44
• 3.2.1 中國(guó)白菜細(xì)菌感染實(shí)驗(yàn)42-43
• 3.2.2 果蠅感染實(shí)驗(yàn)43
• 3.2.3 PA0667對(duì)Swarming運(yùn)動(dòng)能力的影響43-44
• 3.3 PA0666-PA0667操縱子功能的初步探索44-47
• 3.3.1 PA0666-PA0667敲除突變體的構(gòu)建44-45
• 3.3.2 PAO1(△0666-0667)抗生素敏感性檢測(cè)45
• 3.3.3 PA0666-0667外膜穩(wěn)定性與完整性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)45-46
• 3.3.4 PAO1(△0666-0667)白菜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)46-47
• 3.4 基因PA2734功能的研究47-53
• 3.4.1 基因PA2734基本信息47
• 3.4.2 PA2734敲除突變體的構(gòu)建47
• 3.4.3 PA2734敲除突變體的互補(bǔ)體構(gòu)建47-48
• 3.4.4 PAO1(△2734)抗生素敏感性檢測(cè)48-49
• 3.4.5 PA2734運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)49-50
• 3.4.6 PAO1,PAO1(A2734)中檢測(cè)發(fā)光報(bào)道子PilD,fliC的表達(dá)50-51
• 3.4.7 粘附性實(shí)驗(yàn)51-53
• 第四章 結(jié)果與討論53-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 致謝61

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周轉(zhuǎn);90株銅綠假單胞菌血清型及生化反應(yīng)[J];河南醫(yī)藥信息;2002年23期

2 劉蓉,謝芬,周黎明,楊云霞,朱玲,王浴生;對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的銅綠假單胞菌的金屬β-內(nèi)酰胺酶研究[J];四川生理科學(xué)雜志;2004年04期

3 楊海慧,沈薇,應(yīng)春妹,葉楊芹,于嘉屏;神經(jīng)外科病房銅綠假單胞菌流行株分析[J];中國(guó)抗感染化療雜志;2004年06期

4 陳海金,張瑞琴;銅綠假單胞菌醫(yī)院感染及其耐藥性的分析[J];中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析;2005年03期

5 李國(guó)豪 ,徐邦牢 ,李萍 ,雷秀霞;銅綠假單胞菌耐環(huán)丙沙星動(dòng)態(tài)變化[J];中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志;2005年03期

6 楊鳳琴,楊鳳蓮;87株銅綠假單胞菌的分布及藥敏結(jié)果分析[J];中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2005年08期

7 孔晉亮,莫誠(chéng)航,尚為民,鄺敏,覃雪軍,閆萍,陳一強(qiáng);紅霉素、左氧氟沙星對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜作用的體外研究[J];廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2005年03期

8 劉永芳;呂曉菊;;銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥性[J];中國(guó)抗生素雜志;2005年11期

9 關(guān)欣,鄭紅光;銅綠假單胞菌再次感染小鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)人獸共患病雜志;2005年02期

10 吳潤(rùn)轉(zhuǎn);陳艷珍;周勇;;銅綠假單胞菌超廣譜β內(nèi)酰胺酶的檢出及分析[J];華南預(yù)防醫(yī)學(xué);2006年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 丁艷苓;陳亞紅;姚婉貞;寧永忠;;2007年-2009年銅綠假單胞菌的耐藥性分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七屆全國(guó)呼吸道感染學(xué)術(shù)大會(huì)暨第一屆多學(xué)科抗感染治療學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2011年

2 鄧麗華;許美榮;胡麗萍;;銅綠假單胞菌的耐藥性及β-內(nèi)酰胺酶基因的研究[A];第五次全國(guó)中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

3 付建榮;劉群;張艷紅;劉金偉;劉靜;李建;;銅綠假單胞菌燒傷患者分離株β-內(nèi)酰胺類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)耐藥基因研究[A];第四屆全國(guó)燒傷救治專(zhuān)題研討會(huì)燒傷感染救治新進(jìn)展論文匯編[C];2006年

4 陳一強(qiáng);陳海榮;;生物膜形成相關(guān)的銅綠假單胞菌的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第11屆全國(guó)內(nèi)科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2007年

5 曾燕麗;蘭小鵬;江麗;劉豐偉;;滅活銅綠假單胞菌DNA適體的篩選和鑒定[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

6 李超;黃亮;劉慶中;王賽芳;鄭佳音;周鐵麗;;銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶和外膜蛋白缺失的檢測(cè)[A];2008年浙江省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2008年

7 李小燕;卓超;馮景宇;;低濃度乙醇誘導(dǎo)銅綠假單胞菌毒力基因的表達(dá)量變化[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)年會(huì)——2011（第十二次全國(guó)呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議）論文匯編[C];2011年

8 李俊娟;蔣捍東;;亞抑菌濃度抗生素對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)年會(huì)——2011（第十二次全國(guó)呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議）論文匯編[C];2011年

9 李曉玲;高華;劉正祥;;銅綠假單胞菌耐藥性5年連續(xù)監(jiān)測(cè)[A];第十屆全軍檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

10 羅燕萍;沈定霞;裴保香;徐雅萍;白立彥;;銅綠假單胞菌耐藥性與五種抗假單胞菌抗生素使用量相關(guān)性分析[A];第五次全國(guó)中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 俞云松;銅綠假單胞菌耐藥全國(guó)流行[N];健康報(bào);2008年

2 李曙平;銅綠假單胞菌 老年病房的主要致病菌[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2003年

3 王振嶺;銅綠假單胞菌耐藥問(wèn)題嚴(yán)重[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2002年

4 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院檢驗(yàn)科 胡志東;關(guān)注銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物的耐藥[N];健康報(bào);2009年

5 ;碳青霉烯類(lèi)抗生素[N];農(nóng)村醫(yī)藥報(bào)（漢）;2007年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張若文;燒傷病房耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)研究[D];吉林大學(xué);2012年

2 張亞妮;谷胱甘肽與銅綠假單胞菌致病性及抗生素抗性的關(guān)系研究[D];西北大學(xué);2009年

3 陳林;銅綠假單胞菌內(nèi)在耐藥性相關(guān)基因的篩選及研究[D];西北大學(xué);2010年

4 李學(xué)如;銅綠假單胞菌耐喹諾酮類(lèi)藥物的分子機(jī)制研究[D];四川大學(xué);2003年

5 徐洋洋;銅綠假單胞菌致病性受信號(hào)分子調(diào)控及其機(jī)理研究[D];西北大學(xué);2013年

6 徐令清;銅綠假單胞菌對(duì)微生物的抑制作用及機(jī)理探討[D];華中科技大學(xué);2014年

7 魏殿軍;臨床分離菌株耐藥性分析及銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的探討[D];天津醫(yī)科大學(xué);2004年

8 郭俏;銅綠假單胞菌致病因子抑制劑及喹諾酮信號(hào)分子介導(dǎo)的調(diào)節(jié)途徑研究[D];西北大學(xué);2013年

9 孫小敏;氨溴索對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜密度感應(yīng)系統(tǒng)的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

10 路新枝;群體感應(yīng)和環(huán)二鳥(niǎo)苷酸對(duì)銅綠假單胞菌致病因子的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2009年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孫震;銅綠假單胞菌的耐藥性及耐亞胺培南機(jī)制的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2009年

2 謝才文;銅綠假單胞菌多藥耐藥性分子流行病學(xué)研究[D];廣東藥學(xué)院;2010年

3 盧錦萍;兒童銅綠假單胞菌感染臨床特點(diǎn)及高危因素分析[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

4 張?jiān)伱?落葉松皮素對(duì)銅綠假單胞菌生物膜作用的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2004年

5 劉豐偉;體外篩選銅綠假單胞菌適體的研究及初步應(yīng)用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2007年

6 江守偉;2008-2009年安徽省銅綠假單胞菌耐藥性監(jiān)測(cè)[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2012年

7 馮軍花;銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥性及部分耐藥機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2008年

8 李靚;山西太原地區(qū)銅綠假單胞菌的調(diào)查分析及產(chǎn)金屬酶基因型研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

9 王卉;銅綠假單胞菌臨床株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶及其耐藥性的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2005年

10 顧曉花;紅霉素對(duì)銅綠假單胞菌毒力的抑制[D];上海交通大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌與碳青霉烯類(lèi)耐藥相關(guān)基因PA0667,PA2734基因功能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：383933