呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)感染流行地域廣、時(shí)間長(zhǎng),遍布全球,在氣候溫和地區(qū)于寒冷的冬春發(fā)生,在熱帶地區(qū)雨季發(fā)生,是引起嬰幼兒細(xì)支氣管炎和肺炎的重要病原[1,2],在老年人及免疫功能低下的人群中也容易形成嚴(yán)重的呼吸道感染。但由于多種限制因素包括RSV A、B兩亞型交錯(cuò)出現(xiàn),合適的載體蛋白選擇困難等的制約,目前還沒(méi)有成功、安全的疫苗問(wèn)世[6]。RSV所致疾病嚴(yán)重而頻繁地出現(xiàn)于6個(gè)月以下的兒童中,因此WHO已將其列為優(yōu)先發(fā)展的疫苗。 本研究的主要目的是在尋求可能用于RSV疫苗研制的重組蛋白抗原的目標(biāo)下,檢測(cè)我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建載體并表達(dá)出的DsbA-G126-F/M2:81-95蛋白的免疫活性,為進(jìn)一步研究出高效、安全的疫苗打下基礎(chǔ)。在對(duì)G蛋白全長(zhǎng)基因克隆及表達(dá)載體的篩選等工作的基礎(chǔ)上,我們將G蛋白基因100～225的一段與F/M2:81～95片段共同連接進(jìn)pET-15b(DsbA)表達(dá)載體中,于E.coli BL21(DE3)中表達(dá)出目的蛋白,經(jīng)檢測(cè)目的蛋白是以包涵體形式表達(dá),對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化后采用腹腔注射的方法免疫9周齡的雌性BALB/...

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻(xiàn)綜述
    第一章 呼吸道合胞病毒的研究進(jìn)展
        1 吸道合胞病毒研究概況
            1.1 呼吸道合胞病毒的起源分類
            1.2 生物學(xué)特征
                1.2.1 病毒形態(tài)
                1.2.2 侵入釋放
                1.2.3 病毒培養(yǎng)
                1.2.4 抵抗力
            1.3 分子生物學(xué)研究
                1.3.1 F 蛋白
                1.3.2 SH 蛋白
                1.3.3 P 蛋白
            1.4 G 蛋白研究進(jìn)展
                1.4.1 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
                1.4.2 抗原結(jié)構(gòu)
                1.4.3 G 蛋白的進(jìn)化類型
                1.4.4 G 蛋白的免疫作用和致病機(jī)制
            1.5 流行病學(xué)
            1.6 臨床癥狀
            1.7 診斷方法
            1.8 影響 RSV 感染嚴(yán)重程度的因素
                1.8.1 宿主因素
                1.8.2 病毒因素
                1.8.3 地域差異
                1.8.4 其他因素
            1.9 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型
            1.10 RSV 治療藥物進(jìn)展
                1.10.1 人工合成的抗病毒化合物
                1.10.2 天然藥物中獲得的抗病毒藥
            1.11 免疫病理學(xué)
            1.12 疫苗研究進(jìn)展
                1.12.1 保護(hù)性抗原
                1.12.2 福爾馬林滅活 RSV 疫苗
                1.12.3 活病毒疫苗
                1.12.4 遺傳工程疫苗
                1.12.5 載體疫苗
                1.12.6 亞單位疫苗
                1.12.7 質(zhì)粒 DNA 疫苗
                1.12.8 合成肽類疫苗
                1.12.9 佐劑
試驗(yàn)研究
    第二章 pET-DsbA-G126-F/M2:81-95 表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.1 材料
            2.1.1 病毒、菌種和載體
            2.1.2 試劑
        2.2 方法
            2.2.1 質(zhì)粒的提取
            2.2.2 G126 的擴(kuò)增
            2.2.3 CTL 的擴(kuò)增
            2.2.4 G126,CTL 片段的處理
            2.2.5 載體雙酶切鑒定
            2.2.6 連接反應(yīng)
            2.2.7 轉(zhuǎn)化
            2.2.8 PCR 鑒定
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 pET-DsbA-G126-F/M2:81－95 表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.3.2 PCR 擴(kuò)增 G126 片段及 F/M2 片段的結(jié)果
            2.3.3 酶切載體及 F/M2 片段的結(jié)果
            2.3.4 連接轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆
            2.3.5 PCR 鑒定
        2.4 討論
    第三章 重組蛋白 D9-G126-F/M2 的表達(dá)、純化及功能檢測(cè)
        3.1 材料
            3.1.1 病毒、菌種和質(zhì)粒
            3.1.2 試劑
            3.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.2 方法
            3.2.1 預(yù)表達(dá)
            3.2.2 Western blot 檢測(cè)表達(dá)蛋白免疫活性
            3.2.3 融合蛋白的可溶性測(cè)試
            3.2.4 融合蛋白的表達(dá)
            3.2.5 融合蛋白的純化
            3.2.6 細(xì)胞和病毒的培養(yǎng)
            3.2.7 免疫動(dòng)物以及抗體的制備
            3.2.8 中和抗體滴度的檢測(cè)
            3.2.9 ELISA 檢測(cè)抗體滴度
            3.2.10 CTL 檢測(cè)
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 預(yù)表達(dá)
            3.3.2 Western blot 檢測(cè)表達(dá)蛋白免疫活性
            3.3.3 融合蛋白的可溶性測(cè)試
            3.3.4 融合蛋白的純化
            3.3.5 中和抗體滴度的檢測(cè)
            3.3.6 ELISA 檢測(cè)抗體滴度
            3.3.7 CTL 應(yīng)答
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
英文縮略詞
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3815316