本文關(guān)鍵詞：CHO細(xì)胞表達(dá)的人透明質(zhì)酸酶結(jié)構(gòu)與功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的:隨著當(dāng)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展,抗體藥物的應(yīng)用越來越廣泛,由于其用藥劑量大,靜脈注射給藥成為了主要給藥方式,這給患者帶來了很多不便。研究發(fā)現(xiàn)皮下注射給藥能夠降低抗體給藥時(shí)間和相關(guān)花費(fèi),然而也帶來了新的挑戰(zhàn),比如給藥體積的限制。隨著研究的進(jìn)展,r Hu PH20的開發(fā)使得皮下給藥成為了可能,它能夠通過降解皮下細(xì)胞間質(zhì)的透明質(zhì)酸來暫時(shí)增大皮下給藥空間從而增加給藥體積。本研究首先對(duì)r Hu PH20進(jìn)行了CHO細(xì)胞真核表達(dá),隨后我們通過高效液相與質(zhì)譜串聯(lián)對(duì)r Hu PH20的結(jié)構(gòu)從不同水平上進(jìn)行表征鑒定,并對(duì)唾液酸含量進(jìn)行了測(cè)定,然后對(duì)其體內(nèi)、體外生物學(xué)功能進(jìn)行了進(jìn)一步分析,最后將其應(yīng)用在抗PD-L1抗體的制劑開發(fā)中并初步評(píng)估了該抗體的藥代動(dòng)力學(xué)。本研究首次詳細(xì)鑒定了r Hu PH20的糖型結(jié)構(gòu)及位點(diǎn)并為其將來的臨床應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。研究方法:nSDS-PAGE測(cè)定r Hu PH20的表觀分子量。nLC/MS分析r Hu PH20完整蛋白圖譜,確定其準(zhǔn)確分子量。nLC/MS對(duì)r Hu PH20質(zhì)量肽圖譜進(jìn)行分析,對(duì)其糖基化位點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)。nLC/MS對(duì)r Hu PH20游離寡糖類型進(jìn)行鑒定,并對(duì)各糖型進(jìn)行相對(duì)定量。n體外通過濁度法測(cè)定r Hu PH20的體外活性。n體內(nèi)通過細(xì)胞間隙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(臺(tái)盼藍(lán)法)測(cè)定r Hu PH20的活性,開發(fā)抗PD-L1抗體皮下注射制劑及測(cè)定該抗體的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。研究結(jié)果:?SDS-PAGE分析,r Hu PH20分子量與理論分子量基本保持一致。?PNGase F糖苷酶酶切后測(cè)得的r Hu PH20主峰的精確分子量為52261.75 Da。?LC-MS在質(zhì)量肽圖譜分析,鑒定出六個(gè)r Hu PH20 N糖基化位點(diǎn),分別位于第47、131、200、219、333、358位的Asn。?LC-MS在游離寡糖的分析,共確認(rèn)18種糖型,主要以二天線寡糖為主,并且還含有較多高甘露糖。?體內(nèi)外功能分析結(jié)果顯示,r Hu PH20都有較好的活性,并能夠較好促進(jìn)抗PD-L1抗體的吸收,但在PNGase F酶切去除N糖基化修飾后活性顯著降低。
【關(guān)鍵詞】：重組人透明質(zhì)酸酶 糖基化 質(zhì)量肽圖譜 液質(zhì)聯(lián)用 生物活性 藥代動(dòng)力學(xué)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392-33
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 縮略詞表10-11
• 前言11-12
• 第一部分 rHuPH20的構(gòu)建、表達(dá)與鑒定12-17
• 一、實(shí)驗(yàn)材料12-13
• 二、實(shí)驗(yàn)方法13-15
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果15-16
• 四、討論16-17
• 第二部分 rHuPH20結(jié)構(gòu)深度表征17-51
• 一、完整蛋白水平上一級(jí)結(jié)構(gòu)及修飾確認(rèn)17-22
• 二、質(zhì)量肽圖譜水平上糖基化修飾確認(rèn)22-37
• 三、游離寡糖的分析37-46
• 四、唾液酸含量的測(cè)定46-51
• 第三部分 rHuPH20生物活性測(cè)定51-59
• 一、rHuPH20體外活性的測(cè)定51-56
• 二、rHuPH20體內(nèi)活性的測(cè)定56-59
• 第四部分 抗PD-L1抗體rHuPH20混合制劑藥代評(píng)估59-69
• 一、實(shí)驗(yàn)材料59-60
• 二、實(shí)驗(yàn)方法60-63
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果63-68
• 四、討論68-69
• 結(jié)論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-74
• 綜述：透明質(zhì)酸酶的研究進(jìn)展74-90
• 參考文獻(xiàn)82-90
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明90-91
• 致謝91

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