本文關(guān)鍵詞：長期低劑量鎘致正常肝臟細(xì)胞異常增殖及其與caspase-8甲基化的關(guān)系，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的] 應(yīng)用L-02細(xì)胞建立長期低劑量鎘轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型。觀察轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖，凋亡和甲基化的改變，探討長期低劑量鎘導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制。 [方法] 1）鎘轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型的建立與鑒定。MTT法確定鎘培養(yǎng)的濃度，形態(tài)學(xué)分析和WesternBlot確定鎘培養(yǎng)的時(shí)間；臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法和細(xì)胞克隆形成檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖率，倍增時(shí)間和克隆形成率；Transwell檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遷移侵襲能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)化細(xì)胞的周期，ROS水平和凋亡率的變化。 2）轉(zhuǎn)化細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：對照組（正常L-02細(xì)胞），CDT-L-02組（鎘轉(zhuǎn)化細(xì)胞），5-aza組（正常L-02細(xì)胞加5-aza處理），CDT-L-02+5-aza組（鎘轉(zhuǎn)化細(xì)胞加5-aza處理）。臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法檢測各組細(xì)胞的增殖率；流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率的變化；WesternBlot檢測各組細(xì)胞DNMTs，凋亡和周期相關(guān)蛋白以及PCNA表達(dá)的變化；限制性內(nèi)切酶酶切電泳和MSP檢測各組細(xì)胞基因組DNA甲基化和caspase-8基因啟動子甲基化的水平。 3）癌細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：對照組（正常L-02細(xì)胞），CDT-L-02組（鎘轉(zhuǎn)化細(xì)胞），HepG-2組（肝癌細(xì)胞），HepG-2+5-aza組（肝癌細(xì)胞加5-aza處理）。臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法檢測甲基化抑制劑5-aza處理后肝癌細(xì)胞HepG-2活性；MSP檢測5-aza處理后肝癌細(xì)胞HepG-2caspase-8啟動子甲基化的水平；WesternBlot檢測5-aza處理后肝癌細(xì)胞HepG-2DNMT1，caspase-8的表達(dá)。 [結(jié)果] 1）1μM氯化鎘培養(yǎng)L-02細(xì)胞第2周時(shí)，細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生變化，，細(xì)胞長軸逐漸變長；10周時(shí)，細(xì)胞從方形變成長梭形，與正常對照組相比，轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNMT1表達(dá)穩(wěn)定升高，Caspase-8表達(dá)穩(wěn)定下降，p＜0.05。與正常對照組L-02細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖率，克隆形成率和遷移侵襲能力明顯升高，p＜0.05，但是ROS的產(chǎn)生，倍增時(shí)間和凋亡率明顯減少，p＜0.05。 2）轉(zhuǎn)化細(xì)胞在甲基化抑制劑5-aza的作用下，與正常對照組相比，升高的增殖率明顯下降，減少的凋亡率明顯增加，p＜0.05；DNMTs，Caspase-8與其他凋亡和周期相關(guān)蛋白的表達(dá)在5-aza的作用下恢復(fù)到正常對照組的水平，p＜0.05；基因組和caspase-8基因啟動子甲基化的水平也有所恢復(fù)。 3）5-aza作用48h，與HepG-2組相比HepG-2+5-aza組的細(xì)胞活性明顯下降，p＜0.05； DNMT1表達(dá)減少，Caspase-8表達(dá)增加，p＜0.05；與正常L-02細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞HepG-2caspase-8基因啟動子甲基化水平較高，5-aza的作用使肝癌細(xì)胞HepG-2caspase-8基因啟動子甲基化水平下降。 [結(jié)論] 1.長期低劑量鎘能促進(jìn)正常肝細(xì)胞L-02增殖增加，凋亡減少，并改變細(xì)胞的形態(tài)，導(dǎo)致正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。 2.長期低劑量鎘導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制是其提高了基因組DNA和caspase-8基因啟動子甲基化的水平；肝癌細(xì)胞的惡性增殖也與caspase-8基因啟動子異常甲基化有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：長期低劑量鎘 轉(zhuǎn)化 甲基化 caspase-8 增殖 凋亡
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R363
【目錄】：

• 前言5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-14
• 英文縮寫詞表14-15
• 第1章 文獻(xiàn)綜述15-23
• 1.1 鎘的毒性15-16
• 1.2 鎘的致癌性16-17
• 1.3 鎘與細(xì)胞增殖17-18
• 1.4 鎘與凋亡18-20
• 1.5 鎘與 DNA 甲基化20-23
• 1.5.1 高甲基化20-21
• 1.5.2 低甲基化21-23
• 第2章 材料與方法23-33
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞23
• 2.1.2 主要儀器與設(shè)備23-24
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-33
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)25-26
• 2.2.2 MTT 確定長期培養(yǎng) L-02 的氯化鎘濃度26
• 2.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析26
• 2.2.4 Transwell 檢測細(xì)胞遷移侵襲能力26-27
• 2.2.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)27
• 2.2.6 臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞增殖率，倍增時(shí)間和細(xì)胞活力27-28
• 2.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi) ROS 水平28
• 2.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率28
• 2.2.9 WB 檢測蛋白表達(dá)28-30
• 2.2.10 限制性內(nèi)切酶酶切電泳法檢測基因組 DNA 甲基化水平30-31
• 2.2.11 MSP（甲基化特異性 PCR）31-32
• 2.2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析32-33
• 第3章 結(jié)果33-48
• 3.1 鎘與人正常肝細(xì)胞 L-0233-45
• 3.1.1 MTT 確定鎘作用濃度33-34
• 3.1.2 根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和蛋白表達(dá)變化確定鎘作用時(shí)間34-35
• 3.1.3 轉(zhuǎn)化細(xì)胞增殖能力和 ROS 的變化35-38
• 3.1.4 轉(zhuǎn)化細(xì)胞基因組甲基化水平的變化38
• 3.1.5 5-aza 對轉(zhuǎn)化細(xì)胞蛋白表達(dá)，凋亡，增殖能力的影響38-43
• 3.1.6 5-aza 對 caspase-8 基因啟動子甲基化的影響43-45
• 3.2 DNA 甲基化與肝癌細(xì)胞 HepG-245-48
• 3.2.1 5-aza 對肝癌細(xì)胞 caspase-8 基因啟動子甲基化的影響45-46
• 3.2.2 5-aza 對肝癌細(xì)胞蛋白表達(dá)和細(xì)胞活性的影響46-48
• 第4章 討論48-52
• 第5章 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-66
• 在讀期間所取得的科研成果66-67
• 獲獎經(jīng)歷67-68
• 致謝68-69

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：長期低劑量鎘致正常肝臟細(xì)胞異常增殖及其與caspase-8甲基化的關(guān)系，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：380997