本文關(guān)鍵詞：LYG1在炎癥反應(yīng)中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人類基因組計(jì)劃的完成使我們對(duì)于基因有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí),我們確定了基因組中的基因編碼序列,但是對(duì)于其功能卻知之甚少。因此生命科學(xué)的發(fā)展的重點(diǎn)也轉(zhuǎn)向了功能基因組學(xué),基因的功能研究也因此成為研究熱點(diǎn)。通過(guò)研究篩選發(fā)現(xiàn)了一些對(duì)免疫細(xì)胞有調(diào)控作用的功能未知的新基因,LYG1就是其中之一。LYG1定位于chr2q11.2,在各種屬之間同源性較高,為保守基因,編碼一個(gè)194個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),編碼產(chǎn)物分子量21k Da,等電點(diǎn)(p I)8.168。應(yīng)用Signal P分析其N端的19個(gè)氨基酸是典型的信號(hào)肽,且沒有跨膜區(qū)域,推測(cè)LYG1蛋白是一個(gè)分泌型蛋白。LYG1在人體包括免疫系統(tǒng)在內(nèi)的多種組織中均有表達(dá),在免疫系統(tǒng)中表達(dá)稍高,可能參與炎癥的發(fā)生與發(fā)展,在抗病毒、抗胞內(nèi)病毒感染、抗腫瘤方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。目的:建立小鼠肺炎克雷伯桿菌肺炎模型,體外培養(yǎng)炎癥相關(guān)細(xì)胞,研究LYG1在炎癥反應(yīng)中的作用。方法:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立及分組:BALB/C小鼠分為菌組(Kp)組20只、菌+蛋白組(LYG1+Kp)20只、正常組(Normal)10只。菌+蛋白組(LYG1+Kp)小鼠尾靜脈注射100μl濃度為1 ng/μl的LYG1蛋白,菌組(Kp)小鼠和正常組小鼠尾靜脈注射100μl的生理鹽水,1h后,注射20μl的生理鹽水到正常組小鼠氣管內(nèi),菌+蛋白組(LYG1+Kp)和菌組(Kp)小鼠氣管內(nèi)注射20μl濃度為105cfu/m L的肺克菌。標(biāo)本檢測(cè):肺炎克雷伯桿菌肺炎小鼠模型建立后的3h,6h,12h,24h四個(gè)時(shí)間點(diǎn),取小鼠肺組織與外周血,使用HE染色進(jìn)行病理學(xué)觀察,測(cè)定髓過(guò)氧化物酶(MPO)與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(i NOS)的活性,免疫組化法、RT-PCR方法及蛋白免疫印跡法檢測(cè)炎性因子的表達(dá)。2.體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組和處理:常規(guī)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)。實(shí)驗(yàn)分為PBS對(duì)照組、TNF-α陽(yáng)性對(duì)照組(10ng/m L)、TNF-α(10ng/m L)+LYG1(10ng/m L)組、TNF-α(10ng/m L)+LYG1(100ng/m L)組和LYG1(100ng/m L)組。檢測(cè)方法:CCK-8法檢測(cè)LYG1蛋白對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖的影響;實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法檢測(cè)LYG1蛋白對(duì)HUVECs細(xì)胞分泌炎性因子(IL-6、CXCL-2、MCP-1)及粘附分子水平的影響。結(jié)果:1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)小鼠肺組織HE染色發(fā)現(xiàn)LYG1蛋白能減輕小鼠急性肺炎所造成的肺損傷;(2)肺組織免疫組化顯示LYG1能抑制趨化因子GRO的表達(dá);(3)肺組織勻漿MPO和血清i NOS活性檢測(cè)結(jié)果菌組+蛋白組的二者活性低于菌組,提示LYG1蛋白可以減弱小鼠肺炎模型中肺組織中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn),減輕炎癥損傷;(4)肺組織炎性因子m RNA的PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)菌+蛋白組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)均明顯低于菌組,顯示LYG1蛋白能夠降低肺組織細(xì)胞因子的m RNA表達(dá)水平,減弱肺部炎癥造成的肺損傷;(5)肺組織蛋白免疫印跡法結(jié)果菌+蛋白組與菌組相比,NF-κB的表達(dá)水平有所降低,提示LYG1蛋白能降低炎癥狀態(tài)下NF-κB的表達(dá)水平,LYG1蛋白對(duì)炎癥的緩解可能是通過(guò)NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。3.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)CCK-8法檢測(cè)顯示LYG1蛋白對(duì)經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞增殖起到抑制作用,且抑制作用并沒有隨著蛋白濃度的增加而增強(qiáng)。(2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HUVECs細(xì)胞炎性因子m RNA水平發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)TNF-α刺激后,各組細(xì)胞的IL-6、MCP-1與CXCL2因子的m RNA水平的表達(dá)量均有所提高,加入LYG1蛋白,三種因子的表達(dá)量有所下降,LYG1蛋白對(duì)細(xì)胞的炎性因子分泌有一定的抑制作用。低濃度蛋白組比高濃度蛋白組對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性因子的抑制作用更強(qiáng)。(3)蛋白免疫印跡法檢測(cè)HUVECs細(xì)胞VCAM-1蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)TNF+LYG1組與TNF組相比,VCAM-1表達(dá)量有所下降,結(jié)果提示LYG1蛋白能夠抑制粘附分子VCAM-1的表達(dá),可能有抑制白細(xì)胞黏附等作用。結(jié)論:1.建立小鼠肺炎克雷伯桿菌肺炎模型,通過(guò)檢測(cè)多種炎性及相關(guān)因子的表達(dá)或活性可知LYG1蛋白在急性肺部炎癥中起到了抑制作用。2.通過(guò)檢測(cè)LYG1蛋白對(duì)于HUVECs細(xì)胞增殖和各種炎性因子的表達(dá)情況,可知LYG1蛋白能夠抑制HUVECs細(xì)胞的增殖和炎性因子的分泌。
【關(guān)鍵詞】：LYG1 克雷伯桿菌肺炎 TNF-α HUVECs
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-15
• 材料和方法15-26
• 1. 材料15-16
• 1.1 主要試劑15-16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器16
• 1.3 動(dòng)物16
• 1.4 其他材料及試劑16
• 2.方法16-26
• 2.1 生物信息學(xué)16-17
• 2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)17-22
• 2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)17
• 2.2.2 動(dòng)物分組及模型建立17
• 2.2.3 標(biāo)本采集17
• 2.2.4 肺組織HE染色17-18
• 2.2.5 免疫組化檢測(cè)肺組織的趨化因子的表達(dá)18
• 2.2.6 RT-PCR檢測(cè)肺組織炎性因子18-20
• 2.2.7 肺組織MPO活性測(cè)定20-21
• 2.2.8 外周血誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的檢測(cè)21
• 2.2.9 Western Blotting檢測(cè)肺組織蛋白表達(dá)21-22
• 2.3 體外實(shí)驗(yàn)22-25
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)22
• 2.3.2 細(xì)胞分組及處理22-23
• 2.3.3 CCK-8 方法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞增殖23
• 2.3.4 Real-time q PCR檢測(cè)細(xì)胞炎性因子23-25
• 2.3.5 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)25
• 2.4 統(tǒng)計(jì)分析25-26
• 結(jié)果26-35
• 1.LYG1生物信息學(xué)分析26-27
• 2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-31
• 2.1 LYG1蛋白能減輕小鼠急性肺炎造成的肺損傷27
• 2.2 LYG1蛋白能夠降低GRO的表達(dá)27-28
• 2.3 LYG1蛋白在肺炎模型中能夠抑制MPO的活性28-29
• 2.4 LYG1蛋白在肺炎模型中能夠抑制iNOS的活性29
• 2.5 LYG1蛋 白能夠降低肺炎過(guò)程中細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)平29-30
• 2.6 LYG1蛋白能夠降低肺炎模型中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的蛋白表達(dá)水平30-31
• 3.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-35
• 3.1 LYG1蛋白對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖的抑制31-32
• 3.2 LYG1蛋白對(duì)HUVECs細(xì)胞分泌的炎性因子mRNA表達(dá)水平的抑制32-33
• 3.3 LYG1蛋白對(duì)HUVECs細(xì)胞蛋白VCAM-1的影響33-35
• 討論35-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 綜述43-50
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 致謝50-51

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本文編號(hào)：379476