目的:研究甲基結(jié)合蛋白1(Mbd1)對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞克隆形態(tài)及增殖的影響。方法:設(shè)計(jì)針對(duì)Mbd1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的gRNA,將表達(dá)有g(shù)RNA和Cas9蛋白的質(zhì)粒使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞(J1);使用抗生素將未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞殺死后,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7 d,挑取單克隆細(xì)胞,采用PCR法篩選敲除Mbd1的純合子細(xì)胞,觀察Mbd1缺失對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞克隆形態(tài)的影響;使用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)Mbd1對(duì)胚胎干細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:通過Cripsr/Cas9成功獲得敲除Mbd1的胚胎干細(xì)胞,Mbd1缺失后的小鼠胚胎干細(xì)胞喪失了常規(guī)小鼠胚胎干細(xì)胞的3D克隆形態(tài),細(xì)胞呈現(xiàn)單層扁平克隆;Mbd1缺失后小鼠胚胎干細(xì)胞增殖速率變慢。結(jié)論:Mbd1通過影響小鼠胚胎干細(xì)胞克隆形態(tài)和增殖而影響胚胎干細(xì)胞的多能性。

【文章頁數(shù)】：5 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 gRNA設(shè)計(jì)及克隆
        1.2.2 小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        1.2.3 基因敲除細(xì)胞的鑒定
        1.2.4 胚胎干細(xì)胞克隆形態(tài)的觀察
        1.2.5 Mbd1蛋白檢測(cè)
2 結(jié)果
    2.1 通過Crispr/Cas9技術(shù)獲得敲除Mbd1的小鼠胚胎干細(xì)胞
    2.2 敲除Mbd1的胚胎干細(xì)胞喪失了小鼠胚胎干細(xì)胞經(jīng)典的3D克隆形態(tài)
    2.3 敲除Mbd1對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞增殖的影響
3 討論



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