目的原核表達(dá)弓形蟲(chóng)微線體蛋白6(TgMIC6)結(jié)構(gòu)功能域,并制備其多克隆抗體。方法運(yùn)用Optigene TM密碼子優(yōu)化分析平臺(tái)對(duì)弓形蟲(chóng)MIC6(TgMIC6)功能區(qū)的編碼序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,合成優(yōu)化后的編碼基因,并將其克隆入pET30a原核表達(dá)載體,構(gòu)建pET30a-MIC6重組質(zhì)粒;重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá),經(jīng)His親和層析純化后以His單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot鑒定。用純化的融合蛋白免疫新西蘭大白兔,制備多克隆抗體,抗體純化后分別運(yùn)用ELISA和Western blot對(duì)其效價(jià)和特異性進(jìn)行分析。結(jié)果成功構(gòu)建了pET30a-MIC6原核表達(dá)載體。表達(dá)的TgMIC6融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為45×10³,與預(yù)期相符,純化后濃度為0.5 mg/ml。以純化的融合蛋白為抗原制備兔源性抗血清,ELISA測(cè)定其效價(jià)為1∶25 600,抗體濃度3.2 mg/ml,純度>90%,Western blot顯示該抗體能識(shí)別TgMIC6重組蛋白和不同蟲(chóng)株內(nèi)的天然MIC6蛋白。結(jié)論優(yōu)化后的TgMIC6功能區(qū)在原核表達(dá)系統(tǒng)...

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【文章目錄】：
材料與方法
    1 材料
    2 方法
        2.1 TgMIC6密碼子優(yōu)化和TgMIC6原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定
        2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.3 重組蛋白的大量表達(dá)
        2.4 重組蛋白的純化及鑒定
        2.5 多克隆抗體的制備及純化
        2.6 TgMIC6多克隆抗體特異性鑒定
結(jié) 果
    1 TgMIC6基因密碼子的優(yōu)化
    2 pET30a-MIC6重組質(zhì)粒的鑒定
    3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
    4 融合蛋白的純化
    5 TgMIC6多克隆抗體的制備及純化
    6 TgMIC6多克隆抗體的特異性驗(yàn)證
討 論



本文編號(hào)：3790366