TAT蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域PTD（殘基47-57）能介導(dǎo)外源蛋白跨膜遞送進入細胞，然而迄今為止，有關(guān)TAT-PTD的跨膜遞送機制仍然不清楚。因此，構(gòu)筑并應(yīng)用模型蛋白，探討TAT-PTD跨膜遞送的機理及其應(yīng)用，對充分發(fā)揮TAT-PTD在臨床治療中的作用具有重要意義。 為構(gòu)筑模型蛋白，本研究先通過PCR擴增目的基因TAT-GFP，把鑒定正確的目的基因TAT-GFP與質(zhì)粒pGEX-2T連接，構(gòu)建了帶有GST標記的pGEX-TAT-GFP質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后，再把在大腸桿菌BL21大量表達的GST-TAT-GFP通過GS-4B親和色譜純化，得到了分子量約為54.3kD的融合蛋白GST-TAT-GFP。 在此基礎(chǔ)上，本文用熒光顯微鏡和熒光分光光度計來檢測純化后呈活性狀態(tài)的融合蛋白GST-TAT-GFP在不同條件下與體外培養(yǎng)的細胞作用，以探討TAT-PTD的跨膜遞送機理。實驗結(jié)果表明：①GST-TAT-GFP能有效跨膜遞送進入多種細胞,不僅能進入細胞質(zhì)，而且可以定位到細胞核周圍。②其遞送動力學(xué)特性如下：對時間和濃度有依賴關(guān)系，15min內(nèi)就可以跨膜遞送進入Hela細胞，隨著濃度的增加進入...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
第一章 綜述
    1.1 TAT-PTD的研究概況
        1.1.1 背景介紹
        1.1.2 TAT-PTD的發(fā)現(xiàn)
        1.1.3 TAT-PTD的跨膜遞送機制的研究
        1.1.4 TAT-PTD的應(yīng)用
            1.1.4.1 小分子的遞送
            1.1.4.2 肽的遞送
            1.1.4.3 蛋白的遞送
            1.1.4.4 反義遞送
            1.1.4.5 體內(nèi)遞送
            1.1.4.6 顆粒遞送
        1.1.5 TAT-PTD的應(yīng)用前景
    1.2 綠色熒光蛋白(green fluorescent ptotein，GFP)
        1.2.1 GFP的來源、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)
        1.2.2 GFP與其它傳統(tǒng)標記物的比較
        1.2.3 GFP標記的檢測方法
        1.2.4 GFP的應(yīng)用
    1.3 本研究課題的來源、研究目的和主要研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗流程
    2.2 實驗試劑和材料
        2.2.1 質(zhì)粒、菌株、細胞株和動物
        2.2.2 主要藥品和試劑
        2.2.3 色譜材料
        2.2.4 培養(yǎng)基
        2.2.5 常用溶液及緩沖液
        2.2.6 主要使用儀器
    2.3 重組質(zhì)粒GST-TAT-GFP的構(gòu)建
        2.3.1 目的基因TAT-GFP的擴增
            2.3.1.1 引物的設(shè)計與合成
            2.3.1.2 引物溶解
            2.3.1.3 PCR擴增體系
            2.3.1.4 目的基因片斷TAT-GFP的回收與純化
        2.3.2 pUCm-TAT-GFP質(zhì)粒載體的構(gòu)建
            2.3.2.1 目的基因片斷TAT-GFP與pUCm-T Vector的連接
            2.3.2.2 pUCm-TAT-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞
                2.3.2.2.1 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞的制備
                2.3.2.2.2 轉(zhuǎn)化
            2.3.2.3 含pUCm-TAT-GFP質(zhì)粒陽性克隆的篩選
            2.3.2.4 pUCm-TAT-GFP質(zhì)粒的酶切
            2.3.2.5 酶切后目的基因片斷TAT-GFP的回收和純化
            2.3.2.6 PCR鑒定
        2.3.3 pGEX-TAT-GFP的質(zhì)粒載體的構(gòu)建
            2.3.3.1 目的基因TAT-GFP與質(zhì)粒pGEX-2T連接
            2.3.3.2 轉(zhuǎn)化和重組子的篩選
                2.3.3.2.1 大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞的制備
                2.3.3.2.2 轉(zhuǎn)化
                2.3.3.2.3 重組子的鑒定
    2.4 融合蛋白的表達、純化及鑒定
        2.4.1 蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析
            2.4.1.1 原理
            2.4.1.2 溶液的配制
            2.4.1.3 實驗步驟
        2.4.2 融合蛋白GST-TAT-GFP與GST-GFP的表達對照
        2.4.3 GST-TAT-GFP融合蛋白高表達克隆的篩選
        2.4.4 融合蛋白GST-TAT-GFP與GST-GFP表達條件的選擇
            2.4.4.1 誘導(dǎo)溫度的選擇
            2.4.4.2 誘導(dǎo)時間的選擇
        2.4.5 融合蛋白的大量表達、純化及SDS-PAGE分析
            2.4.5.1 融合蛋白GST-TAT-GFP與GST-GFP純化的原理
            2.4.5.2 實驗步驟
        2.4.6 融合蛋白的定量(Folin酚法)
            2.4.6.1 試劑
            2.4.6.2 標準曲線的繪制
            2.4.6.3 樣品測定
        2.4.7 融合蛋白的Western blotting鑒定
            2.4.7.1 材料與試劑
            2.4.7.2 實驗步驟
        2.4.8 融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP的熒光學(xué)特性研究
        2.4.9 兩種重組菌上清液、清洗液與菌體裂解液成分的比較
    2.5 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜遞送作用的研究
        2.5.1 細胞培養(yǎng)、樣品處理、實驗結(jié)果觀察與測定
            2.5.1.1 細胞和細胞培養(yǎng)
            2.5.1.2 樣品處理
            2.5.1.3 實驗結(jié)果觀察與測定方法
                2.5.1.3.1 熒光顯微鏡觀察
                2.5.1.3.2 熒光分光光度計定量
        2.5.2 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜遞送機制的研究
            2.5.2.1 細胞種類對GST-TAT-GFP跨膜遞送的影響
                2.5.2.1.1 熒光顯微鏡觀察
                2.5.2.1.2 熒光分光光度計定量
            2.5.2.2 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜遞送的動力學(xué)研究
                2.5.2.2.1 時間的影響
                2.5.2.2.2 濃度的影響
                2.5.2.2.3 溫度對融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜遞送的影響
                    2.5.2.2.3.1 熒光顯微鏡觀察
                    2.5.2.2.3.2 熒光分光光度計定量
            2.5.2.3 細胞代謝作用對GST-TAT-GFP跨膜遞送的影響
            2.5.2.4 硫酸乙酰肝素對融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜遞送的影響
                2.5.2.4.1 熒光顯微鏡觀察
                2.5.2.4.2 熒光分光光度計定量
        2.5.3 融合蛋白GST-TAT-GFP對細胞的毒性研究
            2.5.3.1 融合蛋白對細胞膜完整性的影響
                2.5.3.1.1 原理
                2.5.3.1.2 試劑
                2.5.3.1.3 標準曲線的繪制
                2.5.3.1.4 實驗步驟
            2.5.3.2 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜遞送對細胞的毒性測定
                2.5.3.2.1 試劑
                2.5.3.2.2 實驗步驟
        2.5.4 GST-TAT-GFP跨膜遞送作用在動物體中的應(yīng)用
            2.5.4.1 腹腔注射
            2.5.4.2 皮膚涂抹
                2.5.4.2.1 實驗分組
                2.5.4.2.2 涂抹方法
                2.5.4.2.3 取材與制片
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 重組質(zhì)粒pGEX-TAT-GFP的構(gòu)建
        3.1.1 目的基因TAT-GFP的擴增
        3.1.2 質(zhì)粒載體pGEX-2T和目的基因片斷TAT-GFP的回收
        3.1.3 含pUCm-TAT-GFP質(zhì)粒陽性克隆的篩選
        3.1.4 重組質(zhì)粒pGEX-TAT-GFP的構(gòu)建
    3.2 GST-TAT-GFP與GST-GFP的表達、純化及其鑒定
        3.2.1 融合蛋白GST-TAT-GFP與GST-GFP的表達對照
        3.2.2 融合蛋白GST-TAT-GFP高表達克隆的篩選
        3.2.3 融合蛋白GST-TAT-GFP與GST-GFP表達條件的確定
            3.2.3.1 誘導(dǎo)溫度的選擇
            3.2.3.2 誘導(dǎo)時間的選擇
        3.2.4 融合蛋白的大量表達、純化及SDS-PAGE分析
        3.2.5 融合蛋白的表達量測定
        3.2.6 融合蛋白的Western blotting鑒定
        3.2.7 融合蛋白熒光學(xué)特性的研究
        3.2.8 兩種重組菌上清液、清洗液與菌體裂解液成分的比較
    3.3 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜遞送作用的研究
        3.3.1 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜遞送機制的研究
            3.3.1.1 細胞種類對GST-TAT-GFP跨膜遞送的影響
            3.3.1.2 融合蛋白跨膜GST-TAT-GFP跨膜遞送的動力學(xué)特性
                3.3.1.2.1 時間對融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜遞送的影響
                3.3.1.2.2 濃度對融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜遞送的影響
                3.3.1.2.3 溫度對GST-TAT-GFP跨膜遞送的影響
            3.3.1.3 細胞代謝作用對GST-TAT-GFP跨膜遞送的影響
            3.3.1.4 硫酸乙酰肝素對GST-TAT-GFP跨膜遞送的影響
        3.3.2 融合蛋白GST-TAT-GFP的毒性研究
            3.3.2.1 融合蛋白GST-TAT-GFP對細胞膜完整性的影響
            3.3.2.2 融合蛋白GST-TAT-GFP對細胞的毒性研究
        3.3.3 融合蛋白GST-TAT-GFP跨膜遞送的應(yīng)用
            3.3.3.1 融合蛋白GST-TAT-GFP在小白鼠體內(nèi)組織的跨膜遞送
            3.3.3.2 融合蛋白GST-TAT-GFP在小白鼠皮膚的跨膜遞送
結(jié)論
致謝
參考文獻
附錄:TAT-GFP 測序結(jié)果
個人簡歷、在學(xué)期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3774372