目的 構(gòu)建人皰疹病毒6型(HHV-6)101K被膜蛋白的原核高效表達(dá)克隆，制備用于活動(dòng)性HHV-6感染血清學(xué)診斷的基因工程抗原。 方法 應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)從臨床唾液標(biāo)本分離HHV-6毒株，出現(xiàn)細(xì)胞病變者用HHV-6特異性引物及限制性酶切分析法進(jìn)行初步鑒定；PCR擴(kuò)增HHV-6B 101K被膜蛋白主要抗原決定簇區(qū)(666～834aa)編碼基因片段(nt2347～2853)，并導(dǎo)入T載體進(jìn)行測(cè)序，與Genebank標(biāo)準(zhǔn)毒株序列比較以進(jìn)一步鑒定。目的基因及表達(dá)載體pThioHis A分別經(jīng)雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli BL21，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳-敖合物瓊脂糖樹(shù)脂柱親和層析初步純化，以Western-Blot鑒定其抗原性和特異性。用純化重組蛋白包被ELISA反應(yīng)板，檢測(cè)197份血清中HHV-6 IgM抗體，與間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較，同時(shí)檢測(cè)15份HCMV陽(yáng)性血清，以分析重組蛋白的特異性。 結(jié)果 PCR擴(kuò)增獲得的目的基因序列與Genebank中HHV-6B標(biāo)準(zhǔn)毒株Z29序列一致。HHV-6 101K融合蛋白可在E.coli BL21...

【文章頁(yè)數(shù)】：57 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
1 前言
2 材料和方法
    2.1 主要儀器與設(shè)備
    2.2 主要試劑及其配制
    2.3 目的基因選擇
    2.4 目的基因的獲取和純化
    2.5 載體pThioHis A的制備和純化
    2.6 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.7 重組克隆的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)蛋白的檢測(cè)
    2.8 目的融合蛋白的純化
    2.9 重組蛋白抗原性及特異性分析
3 結(jié)果
    3.1 HHV-6毒株的分離培養(yǎng)及鑒定
    3.2 目的基因的PCR擴(kuò)增
    3.3 目的基因的序列鑒定
    3.4 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
    3.5 表達(dá)融合蛋白的檢測(cè)
    3.6 純化融合蛋白的檢測(cè)
    3.7 重組蛋白抗原性及特異性分析
4 討論
5 小結(jié)
附表
參考文獻(xiàn)
致謝
文獻(xiàn)綜述



本文編號(hào)：3761610