本文關(guān)鍵詞：生物被膜狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核病是世界上最嚴(yán)重的致死性傳染性疾病之一。結(jié)核分枝桿菌作為引起人類(lèi)結(jié)核病的病原微生物，從新石器時(shí)代伴隨人類(lèi)至今，直到目前仍然導(dǎo)致每年約900萬(wàn)人發(fā)病以及接近150萬(wàn)患者死亡。由于結(jié)核分枝桿菌有很強(qiáng)的抗藥性和逃避機(jī)體免疫的能力，結(jié)核病的感染需要6-9月的多種藥物治療。然而，在全世界范圍內(nèi)出現(xiàn)耐多藥菌株和廣泛耐藥菌株使得混合藥物治療變得效果低下并花費(fèi)更長(zhǎng)時(shí)間。 已有研究證實(shí)，結(jié)核分枝桿菌同綠膿桿菌等其他細(xì)菌一樣，，可以在體外形成生物被膜，而且在不同結(jié)核分枝桿菌菌株間存在生物被膜產(chǎn)量的差異；研究同樣表明，結(jié)核分枝桿菌生物被膜的產(chǎn)量與其耐藥性和致病性密切相關(guān)。生物被膜的形成使細(xì)菌的耐藥性提高10-1000倍，約有65-80%的感染被認(rèn)為與生物被膜有關(guān)，結(jié)核分枝桿菌生物被膜的形成為結(jié)核病治療帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。 在本研究中，我們首先利用RNA高通量測(cè)序技術(shù)，進(jìn)行了生物被膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌菌株H37Rv的轉(zhuǎn)錄組對(duì)比，找到一批生物被膜狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的差異表達(dá)基因，然后通過(guò)比較、篩選和驗(yàn)證，建立了基于基因Rv3519的熒光定量PCR分析結(jié)核分枝桿菌菌株生物被膜產(chǎn)量高低的方法，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)分析標(biāo)識(shí)基因表達(dá)就可以判斷菌株的生物被膜產(chǎn)量。 本研究具體開(kāi)展的工作： 1.改進(jìn)了Ojha教授建立的結(jié)核分枝桿菌生物被膜體外培養(yǎng)方法，解決了結(jié)核分枝桿菌生物被膜體外培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、重復(fù)性差問(wèn)題；為了尋找結(jié)核分枝桿菌生物被膜相關(guān)的標(biāo)識(shí)基因，在國(guó)際上首次運(yùn)用了Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)生物被膜狀態(tài)與浮游狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了高通量全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果表明：運(yùn)用改良蘇通培養(yǎng)基在血清瓶中進(jìn)行生物被膜培養(yǎng)，結(jié)核分枝桿菌生物被膜的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)時(shí)間縮短一周。測(cè)序獲得的純凈序列讀取片段組裝成4550個(gè)unigene，其中4007個(gè)與已知基因匹配，543個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本。被膜菌與浮游菌相比，437個(gè)基因差異表達(dá)，其中153個(gè)基因顯著下調(diào)(≤2倍)，284個(gè)基因顯著上調(diào)(≥2倍)。343個(gè)顯著差異基因注釋到377條GO條目，114個(gè)顯著差異基因注釋到86個(gè)KEGG通路中。差異表達(dá)基因主要集中于硫代謝、類(lèi)固醇降解、Atrazine降解、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等相關(guān)通路中，提示生物被膜態(tài)中的細(xì)菌處于饑餓與缺氧狀態(tài)并伴隨著硫同化作用與類(lèi)固醇降解作用的增強(qiáng)，硫代謝通路中的基因除可以作為標(biāo)識(shí)基因外，還可作為抗結(jié)核生物被膜研究的潛在藥物靶標(biāo)。 2.以為測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)，并結(jié)合前期研究結(jié)果，從中選取代表基因Rv3519，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)生物被膜態(tài)的不同結(jié)核分枝桿菌Rv3519表達(dá)水平，結(jié)晶紫染色檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌生物被膜的形成能力，比較分析Rv3519基因表達(dá)與結(jié)核分枝桿菌生物被膜形成能力的關(guān)系。結(jié)果表明：生物被膜形成能力強(qiáng)的結(jié)核分枝桿菌菌株Rv3519基因表達(dá)量高，生物被膜形成能力弱的菌株，Rv3519基因表達(dá)量低。說(shuō)明結(jié)核分枝桿菌生物被膜形成能力與Rv3519基因表達(dá)水平相關(guān)，Rv3519基因可以作為結(jié)核分枝桿菌生物被膜形成能力的潛在分子診斷標(biāo)識(shí)。 總之，本研究通過(guò)RNA高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)生物被膜狀態(tài)和浮游狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，篩選出與結(jié)核生物被膜形成能力相關(guān)的標(biāo)識(shí)基因Rv3519，并建立了熒光定量PCR檢測(cè)生物被膜形成能力的方法，為針對(duì)結(jié)核分枝桿菌生物被膜介導(dǎo)耐藥性的臨床用藥提供參考。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 生物被膜 RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 硫代謝 熒光定量PCR Rv3519
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R378
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 前言12-14
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述14-26
• 第一章 結(jié)核病的現(xiàn)狀研究14-24
• 1.1 結(jié)核分枝桿菌概述14-15
• 1.2 結(jié)核病流行學(xué)15-16
• 1.3 結(jié)核分枝桿菌耐藥研究進(jìn)展16-24
• 第二章 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展24-26
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容26-54
• 第一章 生物被膜狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究26-46
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法27-31
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-40
• 1.4 討論40-44
• 1.5 小結(jié)44-46
• 第二章 結(jié)核分枝桿菌生物被膜形成能力 qRT-PCR方法的建立46-54
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料46
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法46-48
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-51
• 2.4 討論51-53
• 2.5 小結(jié)53-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介62-63
• 作者簡(jiǎn)介及科研成果63-65
• 致謝65-66

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：生物被膜狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：365718