本文關(guān)鍵詞：抗生素相關(guān)性腹瀉模型的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的人類胃腸道寄居著大量的微生物,重量可達1-2kg,數(shù)量多達1014,為人體細胞的10倍,種類高達1000余種,構(gòu)成人體腸道內(nèi)復雜而龐大的微生態(tài)系統(tǒng)。盡管腸道菌群種類繁多,但主要以四大菌門為主：擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和放線菌門。種類不同的腸道菌群相互拮抗、相互協(xié)同,在質(zhì)和量上形成一種動態(tài)平衡,組成人體腸粘膜屏障中的生物屏障部分,在人體中主要發(fā)揮著重要作用：拮抗致病菌,維護黏膜屏障；免疫調(diào)節(jié)(包括全身和局部免疫)；降解食物殘渣,合成營養(yǎng)成分等。一旦腸道微生物群的組成、分布和數(shù)量發(fā)生改變超出自身調(diào)節(jié)能力,即出現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡,可引起腸道乃至全身的一系列病理病生改變,導致諸多疾病的發(fā)生,如抗生素相關(guān)性腸炎、炎癥性腸病(IBD)、腸激惹綜合征(IBS)、腸癌甚至肥胖、糖尿病、冠心病等�？股叵嚓P(guān)性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea,AAD)是指應用抗生素后導致腸道菌群失調(diào)而引起的最常見的醫(yī)源性腹瀉,是很多種抗生素常見的不良反應之一。輕度的AAD主要表現(xiàn)在大便頻次及性狀上的改變,重度的AAD主要表現(xiàn)為致病菌大量繁殖,引起腸黏膜損傷和炎癥,發(fā)生炎癥性腹瀉。其中艱難梭菌感染性腹瀉(CDAD)占了AAD的10%-25%。其他致病菌還有沙門菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、念珠菌、金葡菌等�？股叵嚓P(guān)性腹瀉的危險因素很多,宿主因素方面,包括年齡65歲、女性、免疫力降低、合并嚴重基礎(chǔ)疾病等；抗生素因素方面,幾乎所有的抗生素都會引起抗生素相關(guān)性腹瀉,但對于腸道微生態(tài)的影響及腹瀉出現(xiàn)的概率主要與其抗生素的抗菌譜、藥代動力學、用藥途徑和到達腸腔中的濃度有關(guān)。廣譜抗生素特別是針對腸桿菌及厭氧菌和那些在腸腔殘留濃度較高的抗生素(抗生素較少吸收或不完全吸收或經(jīng)膽汁分泌)較易引起腸道細菌的改變,廣譜青霉素類、頭孢菌素類及克林霉素等引起的腹瀉發(fā)生率較高�，F(xiàn)有研究認為AAD的發(fā)病機理有：抗生素抑制了正常優(yōu)勢菌群的生長,臨床可以表現(xiàn)為無癥狀,或者停用藥物后正常菌群會在短期恢復,對于部分患者正常菌群出現(xiàn)失衡后會導致機會致病菌(如艱難梭菌等)的過度生長,從而出現(xiàn)腹瀉甚至偽膜性腸炎。此外,抗生素造成的菌群失調(diào)還破壞了微生態(tài)的代謝功能,導致碳水化合物吸收減少從而出現(xiàn)滲透性腹瀉,或減少短鏈脂肪酸的產(chǎn)生,從而減少結(jié)腸對于液體的吸收,最終出現(xiàn)分泌性腹瀉。另一方面,抗生素本身所致的變態(tài)反應、毒性作用可直接引起腸粘膜損害和腸上皮纖毛萎縮,從而導致吸收障礙性腹瀉。最后,某些抗生素(如大環(huán)內(nèi)酯類)是胃動素受體的激動劑,而胃動素為胃腸肽,可以刺激胃竇和十二指腸收縮,引起腸蠕動改變,導致腹瀉、腸痙攣和嘔吐。目前微生態(tài)制劑,包括益生菌、益生元和合生元已作為一種新型手段廣泛應用于抗生素相關(guān)性腹瀉的治療,其根本目的在于恢復和穩(wěn)定原來的微生態(tài)系統(tǒng),但其具體的有效性及機理機制研究仍較為匱乏,制備抗生素誘導的腹瀉模型有利于檢驗微生態(tài)制劑對抗生素相關(guān)性腹瀉的治療作用及機理機制研究,此外還有利于微生態(tài)制劑的推廣使用�？股卣T導的腸道菌群失調(diào)腹瀉模型的建立方法有很多,大致可以分為2大類：1.單用抗生素類型使用抗生素各異,包括有頭孢曲松鈉、鹽酸林可霉素或克林霉素、氨芐青霉素、多粘菌素等,甚至兩聯(lián)或三聯(lián)用藥；劑量也各異,采取臨床1-20倍劑量不等進行灌胃,給藥天數(shù)在1-10天不等,如李景等以氨芐青霉素灌胃小鼠,每次灌胃0.5ml(0.45g/ml),2次/d,連續(xù)5d造成腸道菌群失調(diào)腹瀉模型。2.抗生素+致病菌類型主要是在使用抗生素造成菌群失調(diào)的情況下,人為地給予臨床腹瀉病人常見致病菌,造成菌群失調(diào)性腹瀉模型,如熊德鑫等在用氨芐青霉素鈉(15～40g/kg)8小時后喂服攻擊菌(107～109CFU/ml,0.2ml/次)痢疾桿菌、大腸桿菌、傷寒沙門菌造成腹瀉模型。方法雖然很多,但是仍存在許多不足：相關(guān)文獻仍沒有統(tǒng)一的判斷抗生素相關(guān)性腹瀉的動物模型標準,大多文獻只是根據(jù)菌群失調(diào)概念進行判定,對于腹瀉癥狀是否出現(xiàn)有的文獻并沒有提及,有的文獻只是略提腹瀉率,但沒有具體評價標準；此外,造模用的抗生素及其劑量、時間等仍未有統(tǒng)一明確的標準。本研究中,我們試圖根據(jù)臨床腹瀉及菌群失調(diào)定義制定抗生素相關(guān)性腹瀉的標準,用不同劑量的克林霉素或三聯(lián)抗生素制作出穩(wěn)定的、重復性較好的抗生素相關(guān)性腹瀉模型,此外,還通過細菌培養(yǎng)和熒光定量PCR方法動態(tài)監(jiān)測整個造模過程大鼠常見菌群的變化,確定造模用藥時間、劑量和模型的自然病程。方法1.抗生素相關(guān)性腹瀉模型給藥方法及時間：分別用生理鹽水(A)、25mg/ml克林霉素(B)、50mg/ml克林霉素(C)、75mg/ml克林霉素(D)、(25+28+14mg/ml)克林霉素+氨芐西林+鏈霉素(E)、(50+56+28mg/ml)克林霉素+氨芐西林+鏈霉素(F)、(75+84+42mg/ml)克林霉素+氨芐西林+鏈霉素(G)溶液各2ml給予對照組(A)和克林霉素低(B)、中(C)、高(D)劑量組及三聯(lián)抗生素低(E)、中(F)、高(G)劑量組的SD大鼠,共灌胃7天,之后進行為期8天的病程觀察。2.每天對大鼠體重、飲食、飲水、糞便形態(tài)等進行記錄,從第7天至第14天對固定時間收集的大鼠2小時糞便總重進行稱重,并將糞便烤干后計算糞便的干濕重比,用以作為評價大鼠腹瀉癥狀的指標。3.分別于實驗的第1、4、8、11、14天無菌采集各組大鼠糞便,用細菌培養(yǎng)和熒光定量PCR方法對其進行常見菌群的檢測,并對這兩種方法檢測出來的結(jié)果進行對比分析。4.在第11天和第15天各組分別各處死一半的大鼠,采取回腸、盲腸和結(jié)腸組織進行病理學檢測,并收集盲腸糞便進行盲腸細菌定植情況分析。結(jié)果1、體重、飲食、飲水結(jié)果顯示：與對照組相比,各造模組體重變化、飲食量無明顯差異；各克林霉素組飲水量呈升高趨勢,但無劑量相關(guān)性,而三聯(lián)抗生素組飲水量呈升高趨勢,且與劑量呈正比。2、腹瀉癥狀評定糞便形態(tài)結(jié)果顯示：與對照組相比,各造模組(除D組外)給藥第2天開始出現(xiàn)不同程度的軟便、稀便,癥狀在第6、7天最明顯,持續(xù)至第14天,第15天各組癥狀開始有所恢復。不同組間比較發(fā)現(xiàn),B、E、F、G組的癥狀更為明顯而穩(wěn)定。糞便干濕重比值顯示：與對照組相比,各造模組(除D組外)在第7至第14天糞便的干濕重比值明顯下降,且較平穩(wěn),具有明顯統(tǒng)計學差異；此外,克林霉素組劑量與糞便干濕重比值下降程度具有一定負相關(guān)性,三聯(lián)抗生素組無劑量相關(guān)性。2小時糞便總重顯示：雌、雄大鼠糞便總重差異較大；與對照組相比,B、C、F組雌、雄2小時糞便總重均明顯增加,具有統(tǒng)計學差異,D組雌、雄和G組雄性2小時糞便均無明顯統(tǒng)計學差異,E組不同天數(shù)波動范圍較大,有的無明顯統(tǒng)計學差異。3.不同天數(shù)菌群變化細菌培養(yǎng)結(jié)果顯示：對照組在不同天數(shù)菌群基本比較穩(wěn)定。而各造模組從給藥后出現(xiàn)乳酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌明顯下降,大腸桿菌、酵母菌明顯增加,腸球菌、金葡菌和厭氧球菌先被抑制,后在第8天明顯增加,以上在第14天未能恢復正常；而擬桿菌先被抑制,在第14天得到不同程度的恢復。此外,克林霉素組和三聯(lián)抗生素組菌群變化較相似,不同劑量之間也未見明顯統(tǒng)計學差異。熒光定量PCR結(jié)果顯示對照組在不同天數(shù)菌群也比較穩(wěn)定。C組總的細菌無明顯變化,雙歧桿菌、乳酸桿菌明顯下降,大腸桿菌明顯增加,腸球菌、擬桿菌先減少,后在第8天恢復甚至明顯增加,持續(xù)至第11天。F組總的細菌在用藥第四天出現(xiàn)明顯下降,相應的擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、腸球菌均明顯下降,在第8天至11天,雙歧桿菌,乳酸桿菌仍處于較低水平,而擬桿菌、大腸桿菌、腸球菌明顯增加。4.熒光定量PCR和細菌培養(yǎng)結(jié)果對比顯示：用qPCR檢測出擬桿菌數(shù)量高于細菌培養(yǎng)方法,而檢測出大腸桿菌數(shù)量低于細菌培養(yǎng)方法,乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸球菌兩種方法檢出率比較一致。5.盲腸細菌定植結(jié)果顯示：第11天,與對照組相比,C組和F組盲腸定植細菌中總的細菌和擬桿菌無明顯統(tǒng)計學差異,大腸桿菌和腸球菌明顯增加,成為優(yōu)勢菌群,乳酸桿菌和雙歧桿菌明顯下降。第15天,與對照組相比,C組和F組總的細菌無明顯差異,雙歧桿菌、乳酸桿菌得到一定恢復,但是優(yōu)勢菌群仍為擬桿菌、大腸桿菌和腸球菌。6.不同部位組織病理學結(jié)果顯示：在第11天和第15天,與對照組相比,大鼠回腸、結(jié)腸HE染色鏡下觀察無明顯炎癥表現(xiàn),而在盲腸部位,各造模組均出現(xiàn)輕中度炎癥表現(xiàn),其中B、D、F組炎癥程度相對其他造模組更嚴重。結(jié)論1.不同劑量組的克林霉素和三聯(lián)抗生素均能誘導菌群失調(diào),但結(jié)合腹瀉指標,認為B、F組作為抗生素相關(guān)性腹瀉模型更優(yōu)。2.抗生素的劑量與誘導的腹瀉癥狀及菌群失調(diào)及炎癥嚴重程度無明顯劑量相關(guān)性。3.該模型屬于輕中度腹瀉模型,病變部位主要在于盲腸,病程能超過一周。4.熒光定量PCR與細菌培養(yǎng)方法可以相輔相成,更有利于對菌群失調(diào)的檢測
【關(guān)鍵詞】：抗生素 腹瀉 腸道菌群 細菌培養(yǎng) 熒光定量PCR
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R574.62;R-332
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-18
• 前言18-23
• 1 實驗材料23-25
• 1.1 實驗動物23
• 1.2 主要試劑23-24
• 1.3 主要儀器24-25
• 2 實驗方法25-37
• 2.1 動物分組25-27
• 2.2 一般情況觀察27
• 2.3 腹瀉指標評價27
• 2.4 糞便細菌培養(yǎng)分析27-29
• 2.5 糞便熒光定量PCR分析29-34
• 2.6 病理學檢查34-36
• 2.7 統(tǒng)計學分析36-37
• 3 實驗結(jié)果37-76
• 3.1 各組體重的變化37-38
• 3.2 各組飲食量的變化38-39
• 3.3 各組飲水量的變化39-40
• 3.4 糞便形態(tài)變化40-42
• 3.5 糞便干濕重比值變化42-43
• 3.6 兩小時糞便總重43-45
• 3.7 大鼠糞便活菌菌群分析45-58
• 3.8 實時熒光定量PCR菌群分析結(jié)果58-63
• 3.9 大鼠盲腸細菌的定植情況63-66
• 3.10 熒光定量PCR與細菌培養(yǎng)結(jié)果對比66-73
• 3.11 不同部位腸粘膜病理變化73-76
• 4 討論76-82
• 5 小結(jié)82-83
• 參考文獻83-89
• 碩士期間發(fā)表的論文89-90
• 致謝90-91

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 楊濤毅;彭珉娟;陳桂華;葉蕾;萬朝敏;;調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群和預防腸道菌群失調(diào)探討[J];四川醫(yī)學;2008年07期

2 王桂英;;鼠李糖乳桿菌片對小鼠腸道菌群失調(diào)性腹瀉的治療作用[J];藥學進展;2009年05期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 唐歡;抗生素所致腸道菌群失衡及乳桿菌對其調(diào)節(jié)作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2007年

  本文關(guān)鍵詞：抗生素相關(guān)性腹瀉模型的構(gòu)建，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：365178