本文關(guān)鍵詞：抗生素相關(guān)性腹瀉模型的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的人類胃腸道寄居著大量的微生物,重量可達(dá)1-2kg,數(shù)量多達(dá)1014,為人體細(xì)胞的10倍,種類高達(dá)1000余種,構(gòu)成人體腸道內(nèi)復(fù)雜而龐大的微生態(tài)系統(tǒng)。盡管腸道菌群種類繁多,但主要以四大菌門為主：擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和放線菌門。種類不同的腸道菌群相互拮抗、相互協(xié)同,在質(zhì)和量上形成一種動(dòng)態(tài)平衡,組成人體腸粘膜屏障中的生物屏障部分,在人體中主要發(fā)揮著重要作用：拮抗致病菌,維護(hù)黏膜屏障；免疫調(diào)節(jié)(包括全身和局部免疫)；降解食物殘?jiān)?合成營(yíng)養(yǎng)成分等。一旦腸道微生物群的組成、分布和數(shù)量發(fā)生改變超出自身調(diào)節(jié)能力,即出現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡,可引起腸道乃至全身的一系列病理病生改變,導(dǎo)致諸多疾病的發(fā)生,如抗生素相關(guān)性腸炎、炎癥性腸病(IBD)、腸激惹綜合征(IBS)、腸癌甚至肥胖、糖尿病、冠心病等�？股叵嚓P(guān)性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea,AAD)是指應(yīng)用抗生素后導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)而引起的最常見的醫(yī)源性腹瀉,是很多種抗生素常見的不良反應(yīng)之一。輕度的AAD主要表現(xiàn)在大便頻次及性狀上的改變,重度的AAD主要表現(xiàn)為致病菌大量繁殖,引起腸黏膜損傷和炎癥,發(fā)生炎癥性腹瀉。其中艱難梭菌感染性腹瀉(CDAD)占了AAD的10%-25%。其他致病菌還有沙門菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、念珠菌、金葡菌等。抗生素相關(guān)性腹瀉的危險(xiǎn)因素很多,宿主因素方面,包括年齡65歲、女性、免疫力降低、合并嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病等；抗生素因素方面,幾乎所有的抗生素都會(huì)引起抗生素相關(guān)性腹瀉,但對(duì)于腸道微生態(tài)的影響及腹瀉出現(xiàn)的概率主要與其抗生素的抗菌譜、藥代動(dòng)力學(xué)、用藥途徑和到達(dá)腸腔中的濃度有關(guān)。廣譜抗生素特別是針對(duì)腸桿菌及厭氧菌和那些在腸腔殘留濃度較高的抗生素(抗生素較少吸收或不完全吸收或經(jīng)膽汁分泌)較易引起腸道細(xì)菌的改變,廣譜青霉素類、頭孢菌素類及克林霉素等引起的腹瀉發(fā)生率較高�，F(xiàn)有研究認(rèn)為AAD的發(fā)病機(jī)理有：抗生素抑制了正常優(yōu)勢(shì)菌群的生長(zhǎng),臨床可以表現(xiàn)為無(wú)癥狀,或者停用藥物后正常菌群會(huì)在短期恢復(fù),對(duì)于部分患者正常菌群出現(xiàn)失衡后會(huì)導(dǎo)致機(jī)會(huì)致病菌(如艱難梭菌等)的過(guò)度生長(zhǎng),從而出現(xiàn)腹瀉甚至偽膜性腸炎。此外,抗生素造成的菌群失調(diào)還破壞了微生態(tài)的代謝功能,導(dǎo)致碳水化合物吸收減少?gòu)亩霈F(xiàn)滲透性腹瀉,或減少短鏈脂肪酸的產(chǎn)生,從而減少結(jié)腸對(duì)于液體的吸收,最終出現(xiàn)分泌性腹瀉。另一方面,抗生素本身所致的變態(tài)反應(yīng)、毒性作用可直接引起腸粘膜損害和腸上皮纖毛萎縮,從而導(dǎo)致吸收障礙性腹瀉。最后,某些抗生素(如大環(huán)內(nèi)酯類)是胃動(dòng)素受體的激動(dòng)劑,而胃動(dòng)素為胃腸肽,可以刺激胃竇和十二指腸收縮,引起腸蠕動(dòng)改變,導(dǎo)致腹瀉、腸痙攣和嘔吐。目前微生態(tài)制劑,包括益生菌、益生元和合生元已作為一種新型手段廣泛應(yīng)用于抗生素相關(guān)性腹瀉的治療,其根本目的在于恢復(fù)和穩(wěn)定原來(lái)的微生態(tài)系統(tǒng),但其具體的有效性及機(jī)理機(jī)制研究仍較為匱乏,制備抗生素誘導(dǎo)的腹瀉模型有利于檢驗(yàn)微生態(tài)制劑對(duì)抗生素相關(guān)性腹瀉的治療作用及機(jī)理機(jī)制研究,此外還有利于微生態(tài)制劑的推廣使用。抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)腹瀉模型的建立方法有很多,大致可以分為2大類：1.單用抗生素類型使用抗生素各異,包括有頭孢曲松鈉、鹽酸林可霉素或克林霉素、氨芐青霉素、多粘菌素等,甚至兩聯(lián)或三聯(lián)用藥；劑量也各異,采取臨床1-20倍劑量不等進(jìn)行灌胃,給藥天數(shù)在1-10天不等,如李景等以氨芐青霉素灌胃小鼠,每次灌胃0.5ml(0.45g/ml),2次/d,連續(xù)5d造成腸道菌群失調(diào)腹瀉模型。2.抗生素+致病菌類型主要是在使用抗生素造成菌群失調(diào)的情況下,人為地給予臨床腹瀉病人常見致病菌,造成菌群失調(diào)性腹瀉模型,如熊德鑫等在用氨芐青霉素鈉(15～40g/kg)8小時(shí)后喂服攻擊菌(107～109CFU/ml,0.2ml/次)痢疾桿菌、大腸桿菌、傷寒沙門菌造成腹瀉模型。方法雖然很多,但是仍存在許多不足：相關(guān)文獻(xiàn)仍沒有統(tǒng)一的判斷抗生素相關(guān)性腹瀉的動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn),大多文獻(xiàn)只是根據(jù)菌群失調(diào)概念進(jìn)行判定,對(duì)于腹瀉癥狀是否出現(xiàn)有的文獻(xiàn)并沒有提及,有的文獻(xiàn)只是略提腹瀉率,但沒有具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；此外,造模用的抗生素及其劑量、時(shí)間等仍未有統(tǒng)一明確的標(biāo)準(zhǔn)。本研究中,我們?cè)噲D根據(jù)臨床腹瀉及菌群失調(diào)定義制定抗生素相關(guān)性腹瀉的標(biāo)準(zhǔn),用不同劑量的克林霉素或三聯(lián)抗生素制作出穩(wěn)定的、重復(fù)性較好的抗生素相關(guān)性腹瀉模型,此外,還通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)和熒光定量PCR方法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)整個(gè)造模過(guò)程大鼠常見菌群的變化,確定造模用藥時(shí)間、劑量和模型的自然病程。方法1.抗生素相關(guān)性腹瀉模型給藥方法及時(shí)間：分別用生理鹽水(A)、25mg/ml克林霉素(B)、50mg/ml克林霉素(C)、75mg/ml克林霉素(D)、(25+28+14mg/ml)克林霉素+氨芐西林+鏈霉素(E)、(50+56+28mg/ml)克林霉素+氨芐西林+鏈霉素(F)、(75+84+42mg/ml)克林霉素+氨芐西林+鏈霉素(G)溶液各2ml給予對(duì)照組(A)和克林霉素低(B)、中(C)、高(D)劑量組及三聯(lián)抗生素低(E)、中(F)、高(G)劑量組的SD大鼠,共灌胃7天,之后進(jìn)行為期8天的病程觀察。2.每天對(duì)大鼠體重、飲食、飲水、糞便形態(tài)等進(jìn)行記錄,從第7天至第14天對(duì)固定時(shí)間收集的大鼠2小時(shí)糞便總重進(jìn)行稱重,并將糞便烤干后計(jì)算糞便的干濕重比,用以作為評(píng)價(jià)大鼠腹瀉癥狀的指標(biāo)。3.分別于實(shí)驗(yàn)的第1、4、8、11、14天無(wú)菌采集各組大鼠糞便,用細(xì)菌培養(yǎng)和熒光定量PCR方法對(duì)其進(jìn)行常見菌群的檢測(cè),并對(duì)這兩種方法檢測(cè)出來(lái)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。4.在第11天和第15天各組分別各處死一半的大鼠,采取回腸、盲腸和結(jié)腸組織進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè),并收集盲腸糞便進(jìn)行盲腸細(xì)菌定植情況分析。結(jié)果1、體重、飲食、飲水結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,各造模組體重變化、飲食量無(wú)明顯差異；各克林霉素組飲水量呈升高趨勢(shì),但無(wú)劑量相關(guān)性,而三聯(lián)抗生素組飲水量呈升高趨勢(shì),且與劑量呈正比。2、腹瀉癥狀評(píng)定糞便形態(tài)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,各造模組(除D組外)給藥第2天開始出現(xiàn)不同程度的軟便、稀便,癥狀在第6、7天最明顯,持續(xù)至第14天,第15天各組癥狀開始有所恢復(fù)。不同組間比較發(fā)現(xiàn),B、E、F、G組的癥狀更為明顯而穩(wěn)定。糞便干濕重比值顯示：與對(duì)照組相比,各造模組(除D組外)在第7至第14天糞便的干濕重比值明顯下降,且較平穩(wěn),具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；此外,克林霉素組劑量與糞便干濕重比值下降程度具有一定負(fù)相關(guān)性,三聯(lián)抗生素組無(wú)劑量相關(guān)性。2小時(shí)糞便總重顯示：雌、雄大鼠糞便總重差異較大；與對(duì)照組相比,B、C、F組雌、雄2小時(shí)糞便總重均明顯增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,D組雌、雄和G組雄性2小時(shí)糞便均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,E組不同天數(shù)波動(dòng)范圍較大,有的無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.不同天數(shù)菌群變化細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果顯示：對(duì)照組在不同天數(shù)菌群基本比較穩(wěn)定。而各造模組從給藥后出現(xiàn)乳酸桿菌、雙歧桿菌、梭菌明顯下降,大腸桿菌、酵母菌明顯增加,腸球菌、金葡菌和厭氧球菌先被抑制,后在第8天明顯增加,以上在第14天未能恢復(fù)正常；而擬桿菌先被抑制,在第14天得到不同程度的恢復(fù)。此外,克林霉素組和三聯(lián)抗生素組菌群變化較相似,不同劑量之間也未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。熒光定量PCR結(jié)果顯示對(duì)照組在不同天數(shù)菌群也比較穩(wěn)定。C組總的細(xì)菌無(wú)明顯變化,雙歧桿菌、乳酸桿菌明顯下降,大腸桿菌明顯增加,腸球菌、擬桿菌先減少,后在第8天恢復(fù)甚至明顯增加,持續(xù)至第11天。F組總的細(xì)菌在用藥第四天出現(xiàn)明顯下降,相應(yīng)的擬桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、腸球菌均明顯下降,在第8天至11天,雙歧桿菌,乳酸桿菌仍處于較低水平,而擬桿菌、大腸桿菌、腸球菌明顯增加。4.熒光定量PCR和細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果對(duì)比顯示：用qPCR檢測(cè)出擬桿菌數(shù)量高于細(xì)菌培養(yǎng)方法,而檢測(cè)出大腸桿菌數(shù)量低于細(xì)菌培養(yǎng)方法,乳酸桿菌、雙歧桿菌和腸球菌兩種方法檢出率比較一致。5.盲腸細(xì)菌定植結(jié)果顯示：第11天,與對(duì)照組相比,C組和F組盲腸定植細(xì)菌中總的細(xì)菌和擬桿菌無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,大腸桿菌和腸球菌明顯增加,成為優(yōu)勢(shì)菌群,乳酸桿菌和雙歧桿菌明顯下降。第15天,與對(duì)照組相比,C組和F組總的細(xì)菌無(wú)明顯差異,雙歧桿菌、乳酸桿菌得到一定恢復(fù),但是優(yōu)勢(shì)菌群仍為擬桿菌、大腸桿菌和腸球菌。6.不同部位組織病理學(xué)結(jié)果顯示：在第11天和第15天,與對(duì)照組相比,大鼠回腸、結(jié)腸HE染色鏡下觀察無(wú)明顯炎癥表現(xiàn),而在盲腸部位,各造模組均出現(xiàn)輕中度炎癥表現(xiàn),其中B、D、F組炎癥程度相對(duì)其他造模組更嚴(yán)重。結(jié)論1.不同劑量組的克林霉素和三聯(lián)抗生素均能誘導(dǎo)菌群失調(diào),但結(jié)合腹瀉指標(biāo),認(rèn)為B、F組作為抗生素相關(guān)性腹瀉模型更優(yōu)。2.抗生素的劑量與誘導(dǎo)的腹瀉癥狀及菌群失調(diào)及炎癥嚴(yán)重程度無(wú)明顯劑量相關(guān)性。3.該模型屬于輕中度腹瀉模型,病變部位主要在于盲腸,病程能超過(guò)一周。4.熒光定量PCR與細(xì)菌培養(yǎng)方法可以相輔相成,更有利于對(duì)菌群失調(diào)的檢測(cè)
【關(guān)鍵詞】：抗生素 腹瀉 腸道菌群 細(xì)菌培養(yǎng) 熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R574.62;R-332
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-18
• 前言18-23
• 1 實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物23
• 1.2 主要試劑23-24
• 1.3 主要儀器24-25
• 2 實(shí)驗(yàn)方法25-37
• 2.1 動(dòng)物分組25-27
• 2.2 一般情況觀察27
• 2.3 腹瀉指標(biāo)評(píng)價(jià)27
• 2.4 糞便細(xì)菌培養(yǎng)分析27-29
• 2.5 糞便熒光定量PCR分析29-34
• 2.6 病理學(xué)檢查34-36
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析36-37
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-76
• 3.1 各組體重的變化37-38
• 3.2 各組飲食量的變化38-39
• 3.3 各組飲水量的變化39-40
• 3.4 糞便形態(tài)變化40-42
• 3.5 糞便干濕重比值變化42-43
• 3.6 兩小時(shí)糞便總重43-45
• 3.7 大鼠糞便活菌菌群分析45-58
• 3.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR菌群分析結(jié)果58-63
• 3.9 大鼠盲腸細(xì)菌的定植情況63-66
• 3.10 熒光定量PCR與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果對(duì)比66-73
• 3.11 不同部位腸粘膜病理變化73-76
• 4 討論76-82
• 5 小結(jié)82-83
• 參考文獻(xiàn)83-89
• 碩士期間發(fā)表的論文89-90
• 致謝90-91

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 楊濤毅;彭珉娟;陳桂華;葉蕾;萬(wàn)朝敏;;調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群和預(yù)防腸道菌群失調(diào)探討[J];四川醫(yī)學(xué);2008年07期

2 王桂英;;鼠李糖乳桿菌片對(duì)小鼠腸道菌群失調(diào)性腹瀉的治療作用[J];藥學(xué)進(jìn)展;2009年05期

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 唐歡;抗生素所致腸道菌群失衡及乳桿菌對(duì)其調(diào)節(jié)作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：抗生素相關(guān)性腹瀉模型的構(gòu)建，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：365178