目的:體外分析環(huán)磷酸鳥苷是否（cGMP）通過cGMP依賴性蛋白激酶（cGK）調(diào)控人纖溶酶原激活物抑制劑2（PAI-2）基因啟動子活性,闡明PAI-2基因表達的分子調(diào)控機制。方法:構建cGK的真核過表達載體及其小干擾RNA（siRNA）敲減體系,以及PAI-2基因啟動子缺失突變序列雙螢光素酶報告載體,瞬時轉染人肺動脈平滑肌細胞（HPASMCs）,在可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）特異性刺激劑BAY 41-2272處理前后,real-time PCR檢測PKG1（cGK編碼基因）和PAI-2基因的mRNA水平。結果:cGK過表達能顯著上調(diào)細胞內(nèi)PKG1的mRNA水平和蛋白表達水平,cGK siRNA則能顯著降低其表達（P<0.01）;BAY 41-2272處理HPASMCs后,PKG1基因和PAI-2基因的mRNA水平均明顯升高,而cGK siRNA則能抑制該上調(diào)作用（P<0.01）;雙螢光素酶報告基因實驗顯示,cGK過表達顯著上調(diào)PAI-2基因啟動子活性,而cGK敲減組其活性與對照組比較差異無統(tǒng)計學顯著性;BAY 41-2272處理后PAI-2基因啟動子缺失突變體PAI-2-Pr... 

【文章來源】：中國病理生理雜志. 2019,35(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【文章目錄】：
材 料 和 方 法
    1 實驗材料
    2 方法
        2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2 細胞轉染和細胞處理
        2.3 PAI-2啟動子的克隆
        2.4 細胞總RNA提取和RT-PCR
        2.5 Real-time PCR
        2.6 細胞總蛋白提取和Western blot實驗
        2.7 雙螢光素酶報告基因實驗
    3 統(tǒng)計學分析
結 果
    1 cGK過表達和敲減體系驗證
    2 cGMP對PAI-2基因表達的調(diào)控依賴于cGK
    3 cGMP通過cGK調(diào)控PAI-2基因啟動子活性
    4 PAI-2轉錄起始位點上游-1 000～-800 bp為轉錄調(diào)控關鍵位點
討 論


【參考文獻】：
期刊論文
[1]雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的應用研究進展[J]. 耿德玉,原媛,郭華榮.  科技資訊. 2012(21)



本文編號：3616480