本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌糖代謝蛋白CcpA對莢膜多糖的調(diào)控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的肺炎鏈球菌莢膜(Capsule CPS)是肺炎鏈球菌的一種重要的毒力因子,在細菌定植、粘附中發(fā)揮重要作用,可保護細菌免受宿主的吞噬殺傷作用。肺炎鏈球菌莢膜合成基因為一操縱子結(jié)構(gòu),即cps基因座,其表達水平受其上游啟動子的調(diào)控,但目前尚不清楚有哪些蛋白可通過該啟動子調(diào)控這些基因及CPS的合成。我們前期研究通過DNA pulldown實驗篩選到CcpA可能與肺炎鏈球菌莢膜多糖(CPS)基因座啟動子區(qū)域結(jié)合,且CcpA(catabolite control protein A, CcpA)是一種與糖代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,調(diào)控了肺炎鏈球菌多種基因的表達。本研究擬通過EMSA實驗驗證CcpA與cps啟動子序列的結(jié)合,并進一步研究其對莢膜的調(diào)控作用,為了解肺炎鏈球菌莢膜合成的分子機制提供新的實驗證據(jù)。方法利用大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)工程菌原核表達CcpA蛋白,使用Ni2+親和層析的方法純化目的蛋白。利用純化后的CcpA蛋白免疫昆明小鼠并制備多克隆抗體；采用ELISA法測定抗CcpA抗體效價。隨后,利用Westertn blot方法分析CcpA蛋白在肺炎鏈球菌中的保守性。另外,利用EMSA方法分析CcpA與cps基因座啟動子區(qū)域片段的結(jié)合。最后,采用基因重組方法構(gòu)建ccpA基因缺失株和ccpA基因回復株；利用ELISA法測定野生D39菌株、ccpA基因缺失株和ccpA基因回復株的莢膜多糖含量。結(jié)果首先得到了高純度(90%)的CcpA重組蛋白且制備了CcpA多克隆抗體,Western blot結(jié)果顯示CcpA蛋白在多種血清型的肺炎鏈球菌均有表達。EMSA實驗結(jié)果顯示,CcpA蛋白可與cps基因座啟動子區(qū)域結(jié)合,且呈劑量依賴性；ccpA基因缺失時,細菌CPS含量升高,回復表達CcpA蛋白后,CPS含量顯著降低。結(jié)論我們的結(jié)果表明,CcpA是肺炎鏈球菌中一種保守表達的蛋白,可通過與cps基因座啟動子特異性結(jié)合而負性調(diào)控肺炎鏈球菌莢膜多糖的表達。
【關(guān)鍵詞】：肺炎鏈球菌 ccpA基因 莢膜多糖 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 前言12-13
• 技術(shù)路線13-14
• 第一部分 肺炎鏈球菌CcpA蛋白的保守性分析以及與CPS基因座啟動子區(qū)域相互作用的驗證14-26
• 1. 實驗材料14-16
• 1.1 菌株及質(zhì)粒14-15
• 1.2 實驗動物15
• 1.3 實驗試劑15-16
• 1.4 主要儀器16
• 2. 實驗方法16-20
• 2.1 ccpA目的基因的PCR擴增17
• 2.2 pET-28a(+)-ccpA重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建17
• 2.3 重組CcpA蛋白的誘導表達及純化17-18
• 2.4 多克隆抗體的制備18
• 2.5 ELISA法檢測抗血清效價18
• 2.6 Western印跡分析CcpA蛋白保守性18-19
• 2.7 EMSA驗證CcpA蛋白與cps啟動子序列的結(jié)合19-20
• 3. 實驗結(jié)果20-24
• 3.1 ccpA基因擴增產(chǎn)物的鑒定20-21
• 3.2 pET-28a(+)-ccpA重組質(zhì)粒的構(gòu)建21
• 3.3 CcpA重組蛋白的誘導表達及純化21-22
• 3.4 抗CcpA多克隆抗體的效價分析22
• 3.5 CcpA蛋白保守性表達分析22-23
• 3.6 EMSA驗證CcpA蛋白與CPS啟動子片段的結(jié)合23-24
• 4. 討論24-26
• 第二部分 肺炎鏈球菌CcpA蛋白對CPS的調(diào)控作用研究26-44
• 1. 實驗材料26-29
• 1.1 菌株和質(zhì)粒26-27
• 1.2 實驗試劑27-29
• 1.3 主要儀器29
• 2. 實驗方法29-32
• 2.1 ccpA缺失株D39△ccpA的構(gòu)建與鑒定29-31
• 2.2 ccpA回復株(D39△ccpA：：ccpA)的構(gòu)建與鑒定31
• 2.3 莢膜多糖含量檢測31-32
• 2.4 實時熒光定量PCR32
• 2.5 統(tǒng)計方法32
• 3. 實驗結(jié)果32-42
• 3.1 ccpA缺失株(D39AccpA)的構(gòu)建與鑒定32-40
• 3.2 成功構(gòu)建ccpA回復株(D39AccpA：：ccpA)40
• 3.3 ccpA基因缺失或回復表達后,細菌CPS含量的變化40-42
• 4. 討論42-44
• 全文總結(jié)44-45
• 參考文獻45-48
• 文獻綜述48-56
• 參考文獻52-56
• 致謝56-57
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文題錄57

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  本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌糖代謝蛋白CcpA對莢膜多糖的調(diào)控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：358277