發(fā)布時(shí)間：2017-05-11 23:12

  本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌糖代謝蛋白CcpA對(duì)莢膜多糖的調(diào)控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的肺炎鏈球菌莢膜(Capsule CPS)是肺炎鏈球菌的一種重要的毒力因子,在細(xì)菌定植、粘附中發(fā)揮重要作用,可保護(hù)細(xì)菌免受宿主的吞噬殺傷作用。肺炎鏈球菌莢膜合成基因?yàn)橐徊倏v子結(jié)構(gòu),即cps基因座,其表達(dá)水平受其上游啟動(dòng)子的調(diào)控,但目前尚不清楚有哪些蛋白可通過(guò)該啟動(dòng)子調(diào)控這些基因及CPS的合成。我們前期研究通過(guò)DNA pulldown實(shí)驗(yàn)篩選到CcpA可能與肺炎鏈球菌莢膜多糖(CPS)基因座啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,且CcpA(catabolite control protein A, CcpA)是一種與糖代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,調(diào)控了肺炎鏈球菌多種基因的表達(dá)。本研究擬通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CcpA與cps啟動(dòng)子序列的結(jié)合,并進(jìn)一步研究其對(duì)莢膜的調(diào)控作用,為了解肺炎鏈球菌莢膜合成的分子機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。方法利用大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)工程菌原核表達(dá)CcpA蛋白,使用Ni2+親和層析的方法純化目的蛋白。利用純化后的CcpA蛋白免疫昆明小鼠并制備多克隆抗體；采用ELISA法測(cè)定抗CcpA抗體效價(jià)。隨后,利用Westertn blot方法分析CcpA蛋白在肺炎鏈球菌中的保守性。另外,利用EMSA方法分析CcpA與cps基因座啟動(dòng)子區(qū)域片段的結(jié)合。最后,采用基因重組方法構(gòu)建ccpA基因缺失株和ccpA基因回復(fù)株；利用ELISA法測(cè)定野生D39菌株、ccpA基因缺失株和ccpA基因回復(fù)株的莢膜多糖含量。結(jié)果首先得到了高純度(90%)的CcpA重組蛋白且制備了CcpA多克隆抗體,Western blot結(jié)果顯示CcpA蛋白在多種血清型的肺炎鏈球菌均有表達(dá)。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CcpA蛋白可與cps基因座啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,且呈劑量依賴(lài)性；ccpA基因缺失時(shí),細(xì)菌CPS含量升高,回復(fù)表達(dá)CcpA蛋白后,CPS含量顯著降低。結(jié)論我們的結(jié)果表明,CcpA是肺炎鏈球菌中一種保守表達(dá)的蛋白,可通過(guò)與cps基因座啟動(dòng)子特異性結(jié)合而負(fù)性調(diào)控肺炎鏈球菌莢膜多糖的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：肺炎鏈球菌 ccpA基因 莢膜多糖 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R378
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照6-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 前言12-13
• 技術(shù)路線13-14
• 第一部分 肺炎鏈球菌CcpA蛋白的保守性分析以及與CPS基因座啟動(dòng)子區(qū)域相互作用的驗(yàn)證14-26
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 1.1 菌株及質(zhì)粒14-15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物15
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑15-16
• 1.4 主要儀器16
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法16-20
• 2.1 ccpA目的基因的PCR擴(kuò)增17
• 2.2 pET-28a(+)-ccpA重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建17
• 2.3 重組CcpA蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化17-18
• 2.4 多克隆抗體的制備18
• 2.5 ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)18
• 2.6 Western印跡分析CcpA蛋白保守性18-19
• 2.7 EMSA驗(yàn)證CcpA蛋白與cps啟動(dòng)子序列的結(jié)合19-20
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-24
• 3.1 ccpA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定20-21
• 3.2 pET-28a(+)-ccpA重組質(zhì)粒的構(gòu)建21
• 3.3 CcpA重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化21-22
• 3.4 抗CcpA多克隆抗體的效價(jià)分析22
• 3.5 CcpA蛋白保守性表達(dá)分析22-23
• 3.6 EMSA驗(yàn)證CcpA蛋白與CPS啟動(dòng)子片段的結(jié)合23-24
• 4. 討論24-26
• 第二部分 肺炎鏈球菌CcpA蛋白對(duì)CPS的調(diào)控作用研究26-44
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料26-29
• 1.1 菌株和質(zhì)粒26-27
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑27-29
• 1.3 主要儀器29
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法29-32
• 2.1 ccpA缺失株D39△ccpA的構(gòu)建與鑒定29-31
• 2.2 ccpA回復(fù)株(D39△ccpA：：ccpA)的構(gòu)建與鑒定31
• 2.3 莢膜多糖含量檢測(cè)31-32
• 2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR32
• 2.5 統(tǒng)計(jì)方法32
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-42
• 3.1 ccpA缺失株(D39AccpA)的構(gòu)建與鑒定32-40
• 3.2 成功構(gòu)建ccpA回復(fù)株(D39AccpA：：ccpA)40
• 3.3 ccpA基因缺失或回復(fù)表達(dá)后,細(xì)菌CPS含量的變化40-42
• 4. 討論42-44
• 全文總結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 文獻(xiàn)綜述48-56
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 致謝56-57
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文題錄57

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 CQS;美國(guó)耐多藥肺炎鏈球菌的發(fā)生率提高[J];中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報(bào);2001年06期

2 鄔碩平,楊美云,蔣泓宇;警惕肺炎鏈球菌引起的老年腦膜炎[J];上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志;2002年03期

3 張雪梅;肺炎鏈球菌自然轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè);2002年06期

4 宋琳,瞿介明;肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素耐藥的研究進(jìn)展[J];中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志;2003年05期

5 彭燕,徐永濤;菌落形態(tài)發(fā)生變異的肺炎鏈球菌的鑒定[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2004年02期

6 周忠華,劉華,喻華;69株肺炎鏈球菌的體外抗菌藥物活性研究[J];江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn);2004年03期

7 徐禮鋒;鄭雪輝;祝進(jìn);陳芳建;陸軍;;52株肺炎鏈球菌耐藥性分析[J];江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn);2006年01期

8 孫端陽(yáng);施金玲;蔡璇;;126株肺炎鏈球菌臨床菌株的耐藥率分析[J];檢驗(yàn)醫(yī)學(xué);2006年02期

9 黃曉群;龐棟;;肺炎鏈球菌的檢驗(yàn)技術(shù)及其進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)文選;2006年04期

10 邱付蘭;鐘榮榮;;77例肺炎鏈球菌的分布及藥敏分析[J];江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn);2007年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周忠華;劉華;喻華;;69株肺炎鏈球菌的體外抗菌藥物活性研究[A];中華醫(yī)院管理學(xué)會(huì)第十一屆全國(guó)醫(yī)院感染管理學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2004年

2 唐恒;陳勃江;李為民;;219株呼吸道肺炎鏈球菌的分離及耐藥性分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第12次全國(guó)內(nèi)科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

3 張媛媛;王一雯;孫勝利;賀建平;;耐青霉素性肺炎鏈球菌致急性化膿性腦膜炎1例[A];第九屆西北五�。▍^(qū)）檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

4 吳佳學(xué);季海生;朱德全;;兒科痰培養(yǎng)肺炎鏈球菌耐藥分析對(duì)臨床的指導(dǎo)作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

5 黃小翠;崔亞利;;兒童使用的肺炎鏈球菌疫苗研究進(jìn)展[A];第一次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)論文匯編[C];2014年

6 胡惠麗;胡翼云;何樂(lè)健;沈敘莊;高薇;楊永弘;;肺炎鏈球菌在兒童社區(qū)獲得性肺炎死亡病例中致病地位的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十四次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

7 胡慶豐;呂火祥;沃銘毅;;53例呼吸道分離的肺炎鏈球菌耐藥性分析[A];2007年浙江省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2007年

8 高薇;姚開(kāi)虎;俞桑潔;楊永弘;;2000～2005年分離自北京兒童鼻咽部的19群肺炎鏈球菌的耐藥性變化[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五次全國(guó)兒科中青年學(xué)術(shù)交流大會(huì)論文匯編（上冊(cè)）[C];2008年

9 余素飛;厲世笑;傅鷹;陳慧紅;朱海燕;陳文嫻;張慧娜;;肺炎鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的耐藥機(jī)制研究[A];2011年浙江省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2011年

10 黃勇;萬(wàn)根平;顧曉瓊;鄧秋連;梁柳;鐘華敏;;廣州地區(qū)兒童感染肺炎鏈球菌耐藥相關(guān)基因的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 北京兒童醫(yī)院微生物免疫室 姚開(kāi)虎;接種哪種肺炎鏈球菌疫苗好[N];健康報(bào);2007年

2 鄧力;肺炎鏈球菌易攻擊小孩和老人[N];健康報(bào);2007年

3 記者 王丹;兒童肺炎鏈球菌性疾病防治指南發(fā)布[N];健康報(bào);2010年

4 周密;山羊可能感染了肺炎鏈球菌病[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報(bào);2010年

5 記者 吳偉農(nóng);美科學(xué)家繪制出肺炎鏈球菌基因圖譜[N];新華每日電訊;2001年

6 本報(bào)記者 李穎;肺炎鏈球菌遇流感病毒危害更大[N];科技日?qǐng)?bào);2010年

7 衛(wèi)生部北京醫(yī)院 張秀珍;肺炎鏈球菌對(duì)青霉素耐藥率上升快[N];健康報(bào);2008年

8 中華醫(yī)學(xué)會(huì)公共衛(wèi)生學(xué)分會(huì)主任委員 曾光;秋冬季請(qǐng)呵護(hù)好“呼吸大道”[N];健康報(bào);2010年

9 記者 毛黎;遨游天宇的特殊客[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

10 記者 鄭靈巧;流感繼發(fā)肺炎鏈球菌疾病危害大[N];健康報(bào);2010年

  本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌糖代謝蛋白CcpA對(duì)莢膜多糖的調(diào)控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：358277