本文關(guān)鍵詞：分枝桿菌脂質(zhì)組分加強結(jié)核亞單位疫苗效應的初步研宄，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：分枝桿菌細胞壁含豐富的脂質(zhì)組分,其中的一些組分具有抗原性,或具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。本實驗通過篩選分枝桿菌細胞壁脂質(zhì)成分中具有抗結(jié)核作用的組分并初步研究這些脂質(zhì)組分在結(jié)核亞單位疫苗中的作用,為后續(xù)研發(fā)有效的結(jié)核亞單位疫苗做準備。方法：本研究用有機溶劑對卡介苗(BCG)細胞壁總脂成分進行萃取,用硅膠柱色譜法將其分離為非極性脂、中間極性脂和極性脂。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各類脂質(zhì)組分在人群中的免疫原性,酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISPOT)檢測各類脂質(zhì)組分對人群T細胞的免疫反應,并將總脂和各類脂質(zhì)組分分別與佐劑二甲基三十六烷基銨(DDA)-聚肌胞(PolyI:C)混合,進一步與結(jié)核分枝桿菌融合蛋白LT70 (ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c,簡稱LT70)混合,構(gòu)建含脂質(zhì)的結(jié)核亞單位疫苗,分別在在小鼠BCG攻擊模型和家兔皮膚BCG攻擊結(jié)核液化模型中進行保護效率評價。利用小鼠BCG攻擊模型的保護效率評價,包括進行BCG初免后含脂質(zhì)亞單位疫苗的強化免疫保護效率評價。單獨疫苗免疫策略組,用LT70-脂質(zhì)疫苗在0、3、6周時連續(xù)免疫BABL/c小鼠三次；BCG初免-含脂質(zhì)亞單位疫苗加強策略組,用BCG在0周時免疫BABL/c小鼠一次,再用LT70-脂質(zhì)疫苗在9、12周時加強免疫BABL/c小鼠兩次。兩種策略均用BCG和磷酸緩沖液(PBS)免疫組為對照組。末次免疫后5周,滴鼻感染小鼠,3周后檢測小鼠肺臟BCG菌載量,以此評價LT70-脂質(zhì)疫苗的保護效率和強化免疫保護效率。利用家兔皮膚結(jié)核液化模型評價研究含脂質(zhì)亞單位疫苗保護效率,用LT70-脂質(zhì)疫苗在0、3、6周時連續(xù)免疫家兔三次,BCG組在0周時免疫BCG一次,PBS免疫組為對照。末次免疫后6周,家兔腹背部皮內(nèi)注射BCG,形成家兔皮膚結(jié)核感染病灶。每天觀察感染灶結(jié)節(jié)的出現(xiàn)及病理發(fā)展過程,測量結(jié)核結(jié)節(jié)的大小及記錄結(jié)核結(jié)節(jié)到達肉芽腫、破潰、液化高峰以及愈合的時間,當結(jié)節(jié)到達液化高峰時收集各組家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)中的液化物質(zhì),對其中的結(jié)核菌載量進行計數(shù),評價LT70-脂質(zhì)疫苗的保護效率。結(jié)果：結(jié)核病患者脂質(zhì)特異性抗體IgG高于健康人群(P0.05)。在小鼠卡介苗攻擊模型免疫保護效果評價中,含脂質(zhì)亞單位疫苗LT70-總脂組小鼠肺部荷菌數(shù)明顯低于BCG組(P0.05)。在BCG初免-含脂質(zhì)亞單位疫苗加強免疫策略中,LT70-總脂和LT70-中間極性脂組小鼠肺荷菌數(shù)均低于BCG組(P0.01)和LT70組(P0.05)。在家兔皮膚結(jié)核液化模型免疫保護效果評價中,含脂質(zhì)亞單位疫苗LT70-總脂組和LT70-中性脂組家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)液化高峰時的荷菌數(shù)低于LT70組,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。動態(tài)觀察家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)結(jié)果表明：脂質(zhì)可以加快家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)發(fā)生發(fā)展進程,BCG組和LT70-總脂組家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)液化進程較一致,并且相比于其它各組較快。BCG組家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)在BCG攻擊后第3天開始液化,5-7天達液化高峰,時間最早,液化高峰時結(jié)節(jié)體積達到368.19±78.31mm3,在所有實驗組中最大；LT70-總脂組家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)液化進程僅次于BCG組,在攻擊后第4天開始液化,5-8天達液化高峰,液化高峰時結(jié)節(jié)體積達到332.77±61.19 mm3。單獨總脂組和LT70-中性脂組液化進程居中,單獨總脂佐劑組7-10天達液化高峰,LT70-中性脂組10-17天達液化高峰。LT70組和PBS組家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)液化進程最慢,達液化高峰時間最晚,分別為第11-15天和第13-17天。結(jié)論：本研究表明,分枝桿菌脂質(zhì)成分具有較強的免疫原性,與亞單位疫苗聯(lián)合使用時能夠增強亞單位疫苗的抗結(jié)核免疫保護效果,加速家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)發(fā)生發(fā)展進程。其中,中間極性的脂類強化作用明顯,值得深入研究。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 亞單位疫苗 卡介苗 細胞壁 脂質(zhì)
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-13
• 一. 材料與方法13-34
• 1.1 主要儀器設(shè)備13-14
• 1.2 主要實驗材料14
• 1.3 實驗動物14-15
• 1.4 受試人群15
• 1.5 實驗方法15-33
• 1.5.1 BCG培養(yǎng)15-18
• 1.5.2 PPD的制備18-24
• 1.5.3 總脂和各組分脂質(zhì)的萃取分離與檢測24-26
• 1.5.4 各組分脂質(zhì)在人群PBMCs中免疫反應的檢測26-27
• 1.5.5 各組分脂質(zhì)在人群血清中IgG水平的檢測27-29
• 1.5.6 含脂質(zhì)亞單位疫苗LT70-脂質(zhì)的制備方法29-30
• 1.5.7 LT70-脂質(zhì)亞單位疫苗保護效率的評價30-33
• 1.5.7.1 小鼠模型30-32
• 1.5.7.2 家兔皮膚模型32-33
• 1.6 統(tǒng)計學分析方法33-34
• 二、結(jié)果34-45
• 2.1 BCG的培養(yǎng)34
• 2.2 PPD的制備34-36
• 2.2.1 PPD的SDS-PAGE電泳34-35
• 2.2.2 測定PPD的濃度35-36
• 2.3 總脂的萃取與TLC檢測36-37
• 2.4 總脂和各脂質(zhì)組分的2D-TLC檢測37-38
• 2.5 脂質(zhì)各組分對結(jié)核患者T細胞分泌IFN-γ的水平38
• 2.6 脂質(zhì)在人群血清中的特異性IgG水平38-39
• 2.7 LT70-總脂、LT70-中間極性脂和LT70-非極性脂的保護效率檢測39-45
• 2.7.1 小鼠單獨疫苗免疫策略39-40
• 2.7.2 小鼠初免--加強免疫策略40-41
• 2.7.3 家兔皮膚模型41-45
• 討論45-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻49-54
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文和成果54-55
• 致謝55

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5 李s，

本文編號：358637