本文關(guān)鍵詞：分枝桿菌脂質(zhì)組分加強(qiáng)結(jié)核亞單位疫苗效應(yīng)的初步研宄，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：分枝桿菌細(xì)胞壁含豐富的脂質(zhì)組分,其中的一些組分具有抗原性,或具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)通過篩選分枝桿菌細(xì)胞壁脂質(zhì)成分中具有抗結(jié)核作用的組分并初步研究這些脂質(zhì)組分在結(jié)核亞單位疫苗中的作用,為后續(xù)研發(fā)有效的結(jié)核亞單位疫苗做準(zhǔn)備。方法：本研究用有機(jī)溶劑對(duì)卡介苗(BCG)細(xì)胞壁總脂成分進(jìn)行萃取,用硅膠柱色譜法將其分離為非極性脂、中間極性脂和極性脂。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測各類脂質(zhì)組分在人群中的免疫原性,酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(ELISPOT)檢測各類脂質(zhì)組分對(duì)人群T細(xì)胞的免疫反應(yīng),并將總脂和各類脂質(zhì)組分分別與佐劑二甲基三十六烷基銨(DDA)-聚肌胞(PolyI:C)混合,進(jìn)一步與結(jié)核分枝桿菌融合蛋白LT70 (ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c,簡稱LT70)混合,構(gòu)建含脂質(zhì)的結(jié)核亞單位疫苗,分別在在小鼠BCG攻擊模型和家兔皮膚BCG攻擊結(jié)核液化模型中進(jìn)行保護(hù)效率評(píng)價(jià)。利用小鼠BCG攻擊模型的保護(hù)效率評(píng)價(jià),包括進(jìn)行BCG初免后含脂質(zhì)亞單位疫苗的強(qiáng)化免疫保護(hù)效率評(píng)價(jià)。單獨(dú)疫苗免疫策略組,用LT70-脂質(zhì)疫苗在0、3、6周時(shí)連續(xù)免疫BABL/c小鼠三次；BCG初免-含脂質(zhì)亞單位疫苗加強(qiáng)策略組,用BCG在0周時(shí)免疫BABL/c小鼠一次,再用LT70-脂質(zhì)疫苗在9、12周時(shí)加強(qiáng)免疫BABL/c小鼠兩次。兩種策略均用BCG和磷酸緩沖液(PBS)免疫組為對(duì)照組。末次免疫后5周,滴鼻感染小鼠,3周后檢測小鼠肺臟BCG菌載量,以此評(píng)價(jià)LT70-脂質(zhì)疫苗的保護(hù)效率和強(qiáng)化免疫保護(hù)效率。利用家兔皮膚結(jié)核液化模型評(píng)價(jià)研究含脂質(zhì)亞單位疫苗保護(hù)效率,用LT70-脂質(zhì)疫苗在0、3、6周時(shí)連續(xù)免疫家兔三次,BCG組在0周時(shí)免疫BCG一次,PBS免疫組為對(duì)照。末次免疫后6周,家兔腹背部皮內(nèi)注射BCG,形成家兔皮膚結(jié)核感染病灶。每天觀察感染灶結(jié)節(jié)的出現(xiàn)及病理發(fā)展過程,測量結(jié)核結(jié)節(jié)的大小及記錄結(jié)核結(jié)節(jié)到達(dá)肉芽腫、破潰、液化高峰以及愈合的時(shí)間,當(dāng)結(jié)節(jié)到達(dá)液化高峰時(shí)收集各組家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)中的液化物質(zhì),對(duì)其中的結(jié)核菌載量進(jìn)行計(jì)數(shù),評(píng)價(jià)LT70-脂質(zhì)疫苗的保護(hù)效率。結(jié)果：結(jié)核病患者脂質(zhì)特異性抗體IgG高于健康人群(P0.05)。在小鼠卡介苗攻擊模型免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)中,含脂質(zhì)亞單位疫苗LT70-總脂組小鼠肺部荷菌數(shù)明顯低于BCG組(P0.05)。在BCG初免-含脂質(zhì)亞單位疫苗加強(qiáng)免疫策略中,LT70-總脂和LT70-中間極性脂組小鼠肺荷菌數(shù)均低于BCG組(P0.01)和LT70組(P0.05)。在家兔皮膚結(jié)核液化模型免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)中,含脂質(zhì)亞單位疫苗LT70-總脂組和LT70-中性脂組家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)液化高峰時(shí)的荷菌數(shù)低于LT70組,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。動(dòng)態(tài)觀察家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)結(jié)果表明：脂質(zhì)可以加快家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)發(fā)生發(fā)展進(jìn)程,BCG組和LT70-總脂組家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)液化進(jìn)程較一致,并且相比于其它各組較快。BCG組家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)在BCG攻擊后第3天開始液化,5-7天達(dá)液化高峰,時(shí)間最早,液化高峰時(shí)結(jié)節(jié)體積達(dá)到368.19±78.31mm3,在所有實(shí)驗(yàn)組中最大；LT70-總脂組家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)液化進(jìn)程僅次于BCG組,在攻擊后第4天開始液化,5-8天達(dá)液化高峰,液化高峰時(shí)結(jié)節(jié)體積達(dá)到332.77±61.19 mm3。單獨(dú)總脂組和LT70-中性脂組液化進(jìn)程居中,單獨(dú)總脂佐劑組7-10天達(dá)液化高峰,LT70-中性脂組10-17天達(dá)液化高峰。LT70組和PBS組家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)液化進(jìn)程最慢,達(dá)液化高峰時(shí)間最晚,分別為第11-15天和第13-17天。結(jié)論：本研究表明,分枝桿菌脂質(zhì)成分具有較強(qiáng)的免疫原性,與亞單位疫苗聯(lián)合使用時(shí)能夠增強(qiáng)亞單位疫苗的抗結(jié)核免疫保護(hù)效果,加速家兔皮膚結(jié)核結(jié)節(jié)發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。其中,中間極性的脂類強(qiáng)化作用明顯,值得深入研究。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 亞單位疫苗 卡介苗 細(xì)胞壁 脂質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-13
• 一. 材料與方法13-34
• 1.1 主要儀器設(shè)備13-14
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料14
• 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14-15
• 1.4 受試人群15
• 1.5 實(shí)驗(yàn)方法15-33
• 1.5.1 BCG培養(yǎng)15-18
• 1.5.2 PPD的制備18-24
• 1.5.3 總脂和各組分脂質(zhì)的萃取分離與檢測24-26
• 1.5.4 各組分脂質(zhì)在人群PBMCs中免疫反應(yīng)的檢測26-27
• 1.5.5 各組分脂質(zhì)在人群血清中IgG水平的檢測27-29
• 1.5.6 含脂質(zhì)亞單位疫苗LT70-脂質(zhì)的制備方法29-30
• 1.5.7 LT70-脂質(zhì)亞單位疫苗保護(hù)效率的評(píng)價(jià)30-33
• 1.5.7.1 小鼠模型30-32
• 1.5.7.2 家兔皮膚模型32-33
• 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法33-34
• 二、結(jié)果34-45
• 2.1 BCG的培養(yǎng)34
• 2.2 PPD的制備34-36
• 2.2.1 PPD的SDS-PAGE電泳34-35
• 2.2.2 測定PPD的濃度35-36
• 2.3 總脂的萃取與TLC檢測36-37
• 2.4 總脂和各脂質(zhì)組分的2D-TLC檢測37-38
• 2.5 脂質(zhì)各組分對(duì)結(jié)核患者T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平38
• 2.6 脂質(zhì)在人群血清中的特異性IgG水平38-39
• 2.7 LT70-總脂、LT70-中間極性脂和LT70-非極性脂的保護(hù)效率檢測39-45
• 2.7.1 小鼠單獨(dú)疫苗免疫策略39-40
• 2.7.2 小鼠初免--加強(qiáng)免疫策略40-41
• 2.7.3 家兔皮膚模型41-45
• 討論45-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文和成果54-55
• 致謝55

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5 李s，

本文編號(hào)：358637