發(fā)布時間：2017-05-09 13:08

  本文關鍵詞：日本腦炎病毒NS2A蛋白拮抗宿主RNAi免疫的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：RNA干擾(RNA interference,RNAi)的作用機制目前基本清楚,細胞內的RNaseⅢ類的Dicer蛋白識別并切割ds RNA(double-stranded RNA),產(chǎn)生小分子干擾si RNA RNA(small interfering RNA)等非編碼小分子RNA,Argonaute(AGO)蛋白隨即結合這些小分子RNA,將其裝配為RNA誘導的沉默復合體(RNAinduced silencing complex,RISC),RISC特異性降解與小分子RNA序列匹配的靶RNA,或抑制靶RNA的翻譯途徑,最終達到沉默靶基因的目的。目前已有大量研究發(fā)現(xiàn),在植物、昆蟲等低等生物中,RNAi作為一種重要的抗病毒免疫機制發(fā)揮關鍵作用。針對于宿主這種特異的免疫方式,一些植物和昆蟲病毒進化獲得了拮抗宿主RNAi免疫的功能元件VSR(viral suppressor of RNA silencing),能夠有效抑制基于RNAi的抗病毒免疫(RNA-based virus immunity,RVI),實現(xiàn)病毒滋生的感染和傳播。哺乳動物可通過干擾素等天然免疫系統(tǒng)對抗病毒感染,盡管已有研究發(fā)現(xiàn)RNAi通路的存在,但哺乳動物細胞能否利用RNAi對抗病毒感染尚缺乏足夠證據(jù)。日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)屬于黃病毒科黃病毒屬,是一種以庫蚊為傳播媒介的蟲媒病毒。臨床上可以引起嚴重的腦炎癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)疾病,對人類健康和公共衛(wèi)生構成嚴重威脅。其基因組是長約為10976 bp的單股正鏈RNA,包含兩端的非編碼區(qū)和一個單一的開放讀碼框,分別編碼3個結構蛋白以及7個非結構蛋白。作為蟲媒病毒,其天然宿主既包括昆蟲也包括哺乳動物,是研究RNAi免疫通路的理想材料。日本腦炎病毒在哺乳動物宿主中拮抗經(jīng)典的干擾素免疫通路研究已經(jīng)取得較大進展,而其在昆蟲或者哺乳動物中拮抗RNAi免疫的研究還處于起步階段。發(fā)現(xiàn)并確認病毒的VSR對深入認識病毒感染的分子機制具有重要意義,也可進一步以此為工具證明哺乳動物體內存在RNAi抗病毒免疫機制。本研究首先通過真核表達和體外生化等手段對日本腦炎病毒的全部蛋白拮抗RNAi的功能進行了深入分析,發(fā)現(xiàn)NS2A具有拮抗RNAi的功能;進一步通過生物信息學和反向遺傳學技術,分析了NS2A蛋白上可能與RNA具有相互作用的位點,并構建了相應的突變病毒,對其生物學特征進行了初步評價。本研究的內容包括如下兩個部分:一、日本腦炎病毒VSR的篩選與功能研究目前,已知的VSR基本為病毒自身編碼的蛋白,如弗洛克豪斯病毒(Flock house virus,FHV)的B2蛋白。在蚊蟲細胞中,外源加入EGFP的ds RNA/si RNAs可導致EGFP的m RNA降解,而FB2可以保護EGFP的基因組不受到RNAi作用的影響。本部分研究首先在上述系統(tǒng)中共轉染重組表達的日本腦炎病毒的10個蛋白,確定了日本腦炎病毒的NS2A蛋白與FB2具有相類似的功能,可以保護EGFP的m RNA不受到細胞內RNAi通路的降解。隨后,敲除該系統(tǒng)中RNAi通路中的關鍵作用蛋白,以Northern blot的方法進一步證明了日本腦炎病毒的NS2A蛋白與ds RNA/si RNAs相互作用來發(fā)揮VSR的功能,并以此確定了NS2A蛋白是日本腦炎病毒的VSR。由于NS2A蛋白可能與ds RNA/si RNAs結合,而RNA為帶負電分子,因此推測NS2A蛋白上的正電荷氨基酸可能起到了關鍵性的作用。隨后,我們通過生物信息學的方法比對不同的黃病毒NS2A蛋白序列,發(fā)現(xiàn)其中的大部分正電荷氨基酸都非常保守,并且在一定區(qū)域存在多個正電荷氨基酸聚集的現(xiàn)象,這些正電荷氨基酸很有可能發(fā)揮重要作用。進一步研究通過ITASSER蛋白預測網(wǎng)站的數(shù)據(jù)分析,推測出NS2A蛋白的可能折疊方式,并利用Py MOL軟件進行蛋白表面位點分析,發(fā)現(xiàn)正電荷氨基酸位點基本在蛋白跨膜區(qū)以外的折疊連接處。因此,我們推測K26、T33、K84、R98、R140、R163、R171、K193、K226這9個氨基酸可能是影響NS2A蛋白發(fā)揮VSR作用的關鍵位點。二、日本腦炎病毒VSR缺陷型病毒的構建與生物學特征分析根據(jù)上述的實驗結果,采用反向遺傳學的技術手段,在日本腦炎病毒感染性克隆E70的基礎上,通過融合PCR的方法進行NS2A蛋白的單點突變,成功構建了出T33I、K84A、R98A、R140A、R163A、R171A、K193A、K226A 8個帶有點突變的感染性克隆質粒。進行體外轉錄、轉染等實驗操作后,在BHK-21細胞系上成功拯救出了T33I、K84A、R98A、R140A、R163A 5種點突變病毒,并通過反轉錄PCR實驗、病毒蝕斑實驗、間接免疫熒光實驗、確定突變病毒在細胞上具有感染性,并成功引入突變位點,進一步觀察到T33I、K84A、R163A突變病毒形成的蝕斑直徑明顯小于野生型病毒E70。隨后,在C6/36、Aag2、293T細胞系上分別接種E70與突變病毒,通過病毒在細胞上的復制能力顯示病毒的基本生物學特性。實驗結果表明:R98A、R140A、R163A突變病毒在不同細胞系上的生長復制能力與E70基本一致;K84A在3種細胞系上的復制能力都明顯減弱,說明K84A位點可能影響了病毒基因組的基本復制與病毒蛋白的包裝;T33I位點在信號通路缺陷的C6/36細胞上復制與E70基本一致,而在RNAi通路完整的Aag2與293T細胞中復制能力都明顯減弱,說明T33I位點可能影響了病毒VSR的功能。在動物實驗中,本研究分別測定了突變病毒在乳鼠、成鼠上的神經(jīng)毒力與神經(jīng)侵襲力。結果發(fā)現(xiàn)T33I、K84A、R98A位點的突變病毒與E70相比,在神經(jīng)毒力方面明顯減弱,神經(jīng)侵襲力相對減弱。通過上述研究,我們發(fā)現(xiàn)并確認了日本腦炎病毒的NS2A可能是其重要的VSR之一,同時該蛋白的T33I、K84A、R98A對病毒致病性具有重要影響,是關鍵的毒力(神經(jīng)毒力或神經(jīng)侵襲力)位點。上述工作首次在哺乳動物細胞中證實了RNAi調控病毒復制的關鍵作用,對于深刻理解病毒宿主相互作用具有重要意義。
【關鍵詞】：RNA干擾 VSR 日本腦炎病毒 NS2A蛋白
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R373
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-18
• 第一部分 日本腦炎病毒VSR的篩選與功能分析18-33
• 1. 材料與方法18-19
• 2. 方法19-25
• 3. 結果25-30
• 4. 討論30-33
• 第二部分 日本腦炎病毒VSR功能缺陷型病毒的構建與生物學特征分析33-57
• 1. 材料與方法33-34
• 2. 方法34-42
• 3. 結果42-54
• 4. 討論54-57
• 結論57-58
• 參考文獻58-63
• 綜述63-71
• 參考文獻67-71
• 碩士期間撰寫的論著71-72
• 個人簡歷72-73
• 致謝73

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  本文關鍵詞：日本腦炎病毒NS2A蛋白拮抗宿主RNAi免疫的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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