本文關(guān)鍵詞：日本腦炎病毒NS2A蛋白拮抗宿主RNAi免疫的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：RNA干擾(RNA interference,RNAi)的作用機(jī)制目前基本清楚,細(xì)胞內(nèi)的RNaseⅢ類的Dicer蛋白識(shí)別并切割ds RNA(double-stranded RNA),產(chǎn)生小分子干擾si RNA RNA(small interfering RNA)等非編碼小分子RNA,Argonaute(AGO)蛋白隨即結(jié)合這些小分子RNA,將其裝配為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNAinduced silencing complex,RISC),RISC特異性降解與小分子RNA序列匹配的靶RNA,或抑制靶RNA的翻譯途徑,最終達(dá)到沉默靶基因的目的。目前已有大量研究發(fā)現(xiàn),在植物、昆蟲等低等生物中,RNAi作為一種重要的抗病毒免疫機(jī)制發(fā)揮關(guān)鍵作用。針對(duì)于宿主這種特異的免疫方式,一些植物和昆蟲病毒進(jìn)化獲得了拮抗宿主RNAi免疫的功能元件VSR(viral suppressor of RNA silencing),能夠有效抑制基于RNAi的抗病毒免疫(RNA-based virus immunity,RVI),實(shí)現(xiàn)病毒滋生的感染和傳播。哺乳動(dòng)物可通過(guò)干擾素等天然免疫系統(tǒng)對(duì)抗病毒感染,盡管已有研究發(fā)現(xiàn)RNAi通路的存在,但哺乳動(dòng)物細(xì)胞能否利用RNAi對(duì)抗病毒感染尚缺乏足夠證據(jù)。日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)屬于黃病毒科黃病毒屬,是一種以庫(kù)蚊為傳播媒介的蟲媒病毒。臨床上可以引起嚴(yán)重的腦炎癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)疾病,對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅。其基因組是長(zhǎng)約為10976 bp的單股正鏈RNA,包含兩端的非編碼區(qū)和一個(gè)單一的開放讀碼框,分別編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白以及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。作為蟲媒病毒,其天然宿主既包括昆蟲也包括哺乳動(dòng)物,是研究RNAi免疫通路的理想材料。日本腦炎病毒在哺乳動(dòng)物宿主中拮抗經(jīng)典的干擾素免疫通路研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展,而其在昆蟲或者哺乳動(dòng)物中拮抗RNAi免疫的研究還處于起步階段。發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)病毒的VSR對(duì)深入認(rèn)識(shí)病毒感染的分子機(jī)制具有重要意義,也可進(jìn)一步以此為工具證明哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在RNAi抗病毒免疫機(jī)制。本研究首先通過(guò)真核表達(dá)和體外生化等手段對(duì)日本腦炎病毒的全部蛋白拮抗RNAi的功能進(jìn)行了深入分析,發(fā)現(xiàn)NS2A具有拮抗RNAi的功能;進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)和反向遺傳學(xué)技術(shù),分析了NS2A蛋白上可能與RNA具有相互作用的位點(diǎn),并構(gòu)建了相應(yīng)的突變病毒,對(duì)其生物學(xué)特征進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。本研究的內(nèi)容包括如下兩個(gè)部分:一、日本腦炎病毒VSR的篩選與功能研究目前,已知的VSR基本為病毒自身編碼的蛋白,如弗洛克豪斯病毒(Flock house virus,FHV)的B2蛋白。在蚊蟲細(xì)胞中,外源加入EGFP的ds RNA/si RNAs可導(dǎo)致EGFP的m RNA降解,而FB2可以保護(hù)EGFP的基因組不受到RNAi作用的影響。本部分研究首先在上述系統(tǒng)中共轉(zhuǎn)染重組表達(dá)的日本腦炎病毒的10個(gè)蛋白,確定了日本腦炎病毒的NS2A蛋白與FB2具有相類似的功能,可以保護(hù)EGFP的m RNA不受到細(xì)胞內(nèi)RNAi通路的降解。隨后,敲除該系統(tǒng)中RNAi通路中的關(guān)鍵作用蛋白,以Northern blot的方法進(jìn)一步證明了日本腦炎病毒的NS2A蛋白與ds RNA/si RNAs相互作用來(lái)發(fā)揮VSR的功能,并以此確定了NS2A蛋白是日本腦炎病毒的VSR。由于NS2A蛋白可能與ds RNA/si RNAs結(jié)合,而RNA為帶負(fù)電分子,因此推測(cè)NS2A蛋白上的正電荷氨基酸可能起到了關(guān)鍵性的作用。隨后,我們通過(guò)生物信息學(xué)的方法比對(duì)不同的黃病毒NS2A蛋白序列,發(fā)現(xiàn)其中的大部分正電荷氨基酸都非常保守,并且在一定區(qū)域存在多個(gè)正電荷氨基酸聚集的現(xiàn)象,這些正電荷氨基酸很有可能發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步研究通過(guò)ITASSER蛋白預(yù)測(cè)網(wǎng)站的數(shù)據(jù)分析,推測(cè)出NS2A蛋白的可能折疊方式,并利用Py MOL軟件進(jìn)行蛋白表面位點(diǎn)分析,發(fā)現(xiàn)正電荷氨基酸位點(diǎn)基本在蛋白跨膜區(qū)以外的折疊連接處。因此,我們推測(cè)K26、T33、K84、R98、R140、R163、R171、K193、K226這9個(gè)氨基酸可能是影響NS2A蛋白發(fā)揮VSR作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。二、日本腦炎病毒VSR缺陷型病毒的構(gòu)建與生物學(xué)特征分析根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用反向遺傳學(xué)的技術(shù)手段,在日本腦炎病毒感染性克隆E70的基礎(chǔ)上,通過(guò)融合PCR的方法進(jìn)行NS2A蛋白的單點(diǎn)突變,成功構(gòu)建了出T33I、K84A、R98A、R140A、R163A、R171A、K193A、K226A 8個(gè)帶有點(diǎn)突變的感染性克隆質(zhì)粒。進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)操作后,在BHK-21細(xì)胞系上成功拯救出了T33I、K84A、R98A、R140A、R163A 5種點(diǎn)突變病毒,并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)、病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)、確定突變病毒在細(xì)胞上具有感染性,并成功引入突變位點(diǎn),進(jìn)一步觀察到T33I、K84A、R163A突變病毒形成的蝕斑直徑明顯小于野生型病毒E70。隨后,在C6/36、Aag2、293T細(xì)胞系上分別接種E70與突變病毒,通過(guò)病毒在細(xì)胞上的復(fù)制能力顯示病毒的基本生物學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:R98A、R140A、R163A突變病毒在不同細(xì)胞系上的生長(zhǎng)復(fù)制能力與E70基本一致;K84A在3種細(xì)胞系上的復(fù)制能力都明顯減弱,說(shuō)明K84A位點(diǎn)可能影響了病毒基因組的基本復(fù)制與病毒蛋白的包裝;T33I位點(diǎn)在信號(hào)通路缺陷的C6/36細(xì)胞上復(fù)制與E70基本一致,而在RNAi通路完整的Aag2與293T細(xì)胞中復(fù)制能力都明顯減弱,說(shuō)明T33I位點(diǎn)可能影響了病毒VSR的功能。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,本研究分別測(cè)定了突變病毒在乳鼠、成鼠上的神經(jīng)毒力與神經(jīng)侵襲力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)T33I、K84A、R98A位點(diǎn)的突變病毒與E70相比,在神經(jīng)毒力方面明顯減弱,神經(jīng)侵襲力相對(duì)減弱。通過(guò)上述研究,我們發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了日本腦炎病毒的NS2A可能是其重要的VSR之一,同時(shí)該蛋白的T33I、K84A、R98A對(duì)病毒致病性具有重要影響,是關(guān)鍵的毒力(神經(jīng)毒力或神經(jīng)侵襲力)位點(diǎn)。上述工作首次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中證實(shí)了RNAi調(diào)控病毒復(fù)制的關(guān)鍵作用,對(duì)于深刻理解病毒宿主相互作用具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：RNA干擾 VSR 日本腦炎病毒 NS2A蛋白
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-18
• 第一部分 日本腦炎病毒VSR的篩選與功能分析18-33
• 1. 材料與方法18-19
• 2. 方法19-25
• 3. 結(jié)果25-30
• 4. 討論30-33
• 第二部分 日本腦炎病毒VSR功能缺陷型病毒的構(gòu)建與生物學(xué)特征分析33-57
• 1. 材料與方法33-34
• 2. 方法34-42
• 3. 結(jié)果42-54
• 4. 討論54-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 綜述63-71
• 參考文獻(xiàn)67-71
• 碩士期間撰寫的論著71-72
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷72-73
• 致謝73

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