本工作制備了溫度敏感性載體聚異丙基丙烯酰胺-聚精氨酸綴合物（PNIPArg）,考察了PNIPArg和質(zhì)粒DNA的相互作用,研究了不同溫度下PNIPArg對小鼠成肌細(xì)胞（C2C12）的體外基因轉(zhuǎn)染。具體工作主要包括以下方面:1.制備聚異丙基丙烯酰胺-聚精氨酸綴合物,并采用紅外光譜和核磁共振光譜（13C NMR）方法確定產(chǎn)物的形成,濁度方法得到PNIPArg水溶液的低臨界轉(zhuǎn)變溫度LCST為35.2℃。2.考察PNIPArg和質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物的物化性質(zhì),研究溫度響應(yīng)性對于復(fù)合物的形成、復(fù)合物的大小以及穩(wěn)定性的影響。透射電鏡的結(jié)果表明復(fù)合物呈均一的小球狀,其粒徑分布在50-100nm左右。圓二色譜實驗表明,PNIPArg載體對DNA構(gòu)象的影響不大,溫度高于LCST可以使復(fù)合物結(jié)合地更緊密。瓊脂糖凝膠電泳及其酶解實驗都表明升高復(fù)合物形成的溫度可以促進(jìn)復(fù)合物的形成,提高復(fù)合物的穩(wěn)定性。3.以C2C12細(xì)胞為宿主細(xì)胞,考察聚精氨酸載體和溫度敏感PNIPArg載體對于介導(dǎo)含有熒光素酶（luciferase）和綠色熒光蛋白（GFP）報告基因系統(tǒng)的質(zhì)粒PGL3和pEGFP-C1的體外轉(zhuǎn)染。結(jié)果證實P... 

【文章來源】：天津大學(xué)天津市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

非病毒載體/DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)基因過程示意圖

通過圖1－1 可以看出作為非病毒載體必須克服以下幾個苛刻的條件；1.其必須能縮合DNA，形成中性或正電性的復(fù)合物，避免細(xì)胞毒性及與其它細(xì)胞或帶電分子（如細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白特別是補體蛋白）的相互作用，這在體內(nèi)應(yīng)用是很必要的；2.其必須能形成緊密穩(wěn)定的能被細(xì)胞內(nèi)在化的復(fù)合物，這有利于其在血流內(nèi)擴散和簾式內(nèi)皮膜的外滲；3.其必須能夠調(diào)控特定的細(xì)胞識別并進(jìn)入目的細(xì)胞，減小非特異的基因釋放；4.其必須能夠從內(nèi)涵體中逃逸出來并能夠釋放外源基因在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。成功的基因轉(zhuǎn)運還需要保護(hù)DNA免受細(xì)胞內(nèi)核酶的降解，能從內(nèi)吞小泡中釋放DNA或者復(fù)合物，同時復(fù)合物必須能夠在某一階段解離，復(fù)合物擴散通過胞質(zhì)溶膠及DNA高效進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。目前所開發(fā)的非病毒載體還不能完全達(dá)到這些要求[1]。圖 1-1 非病毒載體/DNA 復(fù)合物的轉(zhuǎn)基因過程示意圖1.2.1 裸 DNA裸 DNA 是結(jié)構(gòu)最簡單的非病毒載體，由于其需要避開細(xì)胞內(nèi)外的屏障才能發(fā)揮作用，因此一般都采用物理方法（如基因槍，超聲波，電出孔）導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)染的特定部位（如骨骼肌肉，肝臟，心�。�。但裸 DNA 缺乏靶向性，并且只能3

其作為轉(zhuǎn)基因載體主要有兩種結(jié)構(gòu)：線性聚乙烯基亞胺（L-PEI）和支化聚乙烯基亞胺（B-PEI）（如圖1－3）。PEI的叔胺氮原子可以質(zhì)子化，人們形象的將其稱為“質(zhì)子海綿”。與其他的高聚物載體（聚賴氨酸等）不同，PEI在所有的pH范圍內(nèi)都表現(xiàn)出很好的緩沖能力，在生理pH條件下，只有大約 20％的PEI被質(zhì)子化[32]。PEI有很高的轉(zhuǎn)基因的能力，被認(rèn)為是由于其較高的正電荷密度，并基于這樣的假設(shè)：當(dāng)細(xì)胞的囊泡的pH值變?yōu)樗嵝詴r，質(zhì)子化的PEI可以發(fā)生滲透性溶脹使囊泡破裂，將PEI攜帶的DNA由囊泡釋放到胞漿中。雖然真正的機理還有待進(jìn)一步研究，但可以證明PEI確實是轉(zhuǎn)基因的有效載體[33]。但較高的電荷密度使PEI存在明顯的細(xì)胞毒性

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]殼聚糖納米粒用作基因遞送載體的初步研究[J]. 黃偉,崔光華,賀俊峰,周旭,張強.  藥學(xué)學(xué)報. 2002(12)
[2]納米粒子介導(dǎo)特異基因轉(zhuǎn)染的實驗研究[J]. 李擁軍,管珩,劉昌偉,鄭曰宏,趙三妹,王宗立,楊菁,宋存先.  中華醫(yī)學(xué)雜志. 2002(05)



本文編號：3509371