本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染致T細(xì)胞功能障礙的研究及融合蛋白AEMD和LT70的構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染致T細(xì)胞功能障礙的研究目的：研究導(dǎo)致慢性重癥結(jié)核病患者對(duì)結(jié)核分枝桿菌免疫力降低的機(jī)制,探究結(jié)核分枝桿菌長(zhǎng)期感染持續(xù)激活機(jī)體免疫應(yīng)答是否造成T細(xì)胞功能障礙。方法：從蘭州市肺科醫(yī)院在2013年1月-2014年12月期間收住入院的所有肺結(jié)核患者中,抽取35例患者為實(shí)驗(yàn)組,其中12名為痰菌陽(yáng)性的空洞性肺結(jié)核患者。從蘭州大學(xué)志愿者中抽取6人為正常對(duì)照組,采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的外周血標(biāo)本,從收集到的人血標(biāo)本中分離出淋巴細(xì)胞。通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分析T淋巴細(xì)胞IFN-γ和IL-2分泌水平,用細(xì)胞增殖試驗(yàn)分析T細(xì)胞的增殖能力,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面免疫抑制相關(guān)分子TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain 3)的表達(dá)以及CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)目的變化。結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果顯示,與健康人相比,痰菌陰性的結(jié)核病患者T細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。與健康人和痰菌陰性的結(jié)核病患者相比痰菌陽(yáng)性的空洞性結(jié)核病患者T細(xì)胞的增殖能力明顯下降。與健康人相比,痰菌陽(yáng)性的非空洞性結(jié)核病患者T細(xì)胞IFN-γ的分泌能力明顯增強(qiáng)。但是,與痰菌陽(yáng)性的非空洞性結(jié)核病患者相比,痰菌陽(yáng)性的空洞性結(jié)核病患者T細(xì)胞IFN-γ的分泌能力明顯下降。與健康人相比較痰菌陽(yáng)性的非空洞性結(jié)核病患者和痰菌陽(yáng)性的空洞性結(jié)核病細(xì)胞表面免疫抑制相關(guān)分子TIM-3的表達(dá)增高。但是,結(jié)核病患者組之間相比較TIM-3的表達(dá)無(wú)顯著性差異。與健康人相比結(jié)核病患者T細(xì)胞IL-2的分泌水平明顯下降,而結(jié)核病患者組之間T細(xì)胞IL-2的分泌水平無(wú)顯著性差異。按照患者的年齡分組時(shí),各組之間均不存在差異。結(jié)論：痰菌陽(yáng)性的空洞性結(jié)核病中,結(jié)核分枝桿菌的持續(xù)刺激會(huì)造成患者T淋巴細(xì)胞的功能減弱,T淋巴細(xì)胞增殖能力下降。第二部分融合蛋白AEMD和LT70的構(gòu)建目的：構(gòu)建融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD(AEMD)和ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c(LT70),使其在大腸桿菌BL-21(DE3)中能夠穩(wěn)定表達(dá)。通過(guò)密碼子優(yōu)化和加入linker的方法使其更多的表達(dá)在上清中,各個(gè)抗原能夠正確折疊互不干擾。方法：1.融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD的構(gòu)建：根據(jù)GenBank中結(jié)核分枝桿菌基因esat6、mtb8.4、rpfd的序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR,在酶切位點(diǎn)Bgl Ⅱ、SacⅠ、Hind Ⅲ處依次插入到表達(dá)載體pET-30a(+)中,基因ag85b酶切后在酶切位點(diǎn)Nde Ⅰ、 Bgl Ⅱ處插入到表達(dá)載體pET-30a(+)中,構(gòu)建重組質(zhì)粒Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD- pET-30a(+),將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL-21(DE3)中表達(dá)融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD。由于實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好ESAT6-Mtb8.4的序列,所以根據(jù)ESAT6-Mtb8.4兩端的序列設(shè)計(jì)引物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室以前做的融合蛋白的經(jīng)驗(yàn),把Ag85B放在融合蛋白的前面時(shí),蛋白不表達(dá),因此此次設(shè)計(jì)融合蛋白時(shí),對(duì)Ag85B進(jìn)行了優(yōu)化,首先是對(duì)Ag85B的序列進(jìn)行優(yōu)化,再次是在Ag85B與ESAT6之間加入了linker GGGGS。2.融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c的優(yōu)化：在實(shí)驗(yàn)室原有融合蛋白Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c的基礎(chǔ)上,將ag85b的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化,并在其兩端加入linker (GGGGS) 3。設(shè)計(jì)好的ag85b序列送去合成,合成時(shí)其兩端的酶切位點(diǎn)與原來(lái)Ag85B序列兩端的酶切位點(diǎn)一致。在酶切位點(diǎn)EcoR Ⅰ、 Bgl Ⅱ處插入表達(dá)載體中,構(gòu)建重組質(zhì)粒ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c- pET30a(+),將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL-21(DE3)中表達(dá)融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c。結(jié)果：融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD和ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c成功構(gòu)建,并且其在大腸桿菌BL-21(DE3)中能夠穩(wěn)定表達(dá)。和優(yōu)化前相比,兩種融合蛋白在上清中的表達(dá)都相對(duì)提高。結(jié)論：經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化和linker的加入, 提高了融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD和ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c的表達(dá)效率。此外,密碼子的優(yōu)化和linker的加入能使各個(gè)抗原正確折疊,融合蛋白更多地表達(dá)在上清中。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核病 空洞性結(jié)核 T淋巴細(xì)胞增殖 TIM-3 T細(xì)胞功能障礙 結(jié)核分枝桿菌 融合蛋白 密碼子優(yōu)化 接頭
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一部分 結(jié)核分枝桿菌持續(xù)感染致T細(xì)胞功能障礙的研究11-38
• 前言11-13
• 1.1 材料與儀器13-15
• 1.1.1 研究對(duì)象13-14
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料14
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器14-15
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法15-24
• 1.2.1 ESAT6蛋白的表達(dá)與純化15-17
• 1.2.2 CFP10的表達(dá)與純化17
• 1.2.3 HspX蛋白的表達(dá)與純化17-18
• 1.2.4 ESAT6、HspX、CFP10蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳18-20
• 1.2.5 ESAT6、HspX和CFP10蛋白質(zhì)濃度測(cè)定20-21
• 1.2.6 完全細(xì)胞培養(yǎng)基的配制21
• 1.2.7 分泌IFN-γ的單核淋巴細(xì)胞細(xì)胞數(shù)的檢測(cè)21-23
• 1.2.8 ELISA技術(shù)檢測(cè)IL-2的分泌水平23-24
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-34
• 1.3.1 單個(gè)抗原ESAT6的表達(dá)和純化的結(jié)果24
• 1.3.2 單個(gè)抗原HspX的表達(dá)和純化結(jié)果24-25
• 1.3.3 單個(gè)抗原CFP10的表達(dá)和純化結(jié)果25-26
• 1.3.4 不同人群T細(xì)胞分泌IFN-γ水平的檢測(cè)26-28
• 1.3.5 不同人群的T淋巴細(xì)胞表面分子的表達(dá)情況28-31
• 1.3.6 不同人群之間特異性T淋巴細(xì)胞增殖能力的比較31-33
• 1.3.7 不同人群T淋巴細(xì)胞分泌IL-2的水平33-34
• 1.4 討論34-37
• 1.5 結(jié)論37-38
• 第二部分 融合蛋白AEMD和LT70的構(gòu)建38-57
• 前言38-39
• 2.1 材料與儀器39-40
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料39-40
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器40
• 2.2 試驗(yàn)方法40-48
• 2.2.1 融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD(AEMD)的構(gòu)建40-43
• 2.2.2 利用氯化鈣法制造大腸桿菌E.coli DH5α的感受態(tài)細(xì)胞43-44
• 2.2.3 向DH5α感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物44
• 2.2.4 融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64_(190-198)-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)的優(yōu)化44-45
• 2.2.5 融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD和ESAT6-Ag85B-MPT64_(190-198)-Mtb8.4-Rv2626c的表達(dá)45-46
• 2.2.6 SDS-PAGE蛋白電泳的方法及其相關(guān)試劑的配制46-48
• 2.3 結(jié)果48-54
• 2.3.1 重組質(zhì)粒Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD-pET30a(+)的構(gòu)建48-51
• 2.3.2 融合蛋白Ag85B-ESAT6-Mtb8.4-RpFD的表達(dá)51-52
• 2.3.3 重組質(zhì)粒ESAT6-Ag85B-MPT64_(190-198)-Mtb8.4-Rv2626c-pET30a(+)的優(yōu)化52-53
• 2.3.4 融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64_(190-198)-Mtb8.4-Rv2626c的表達(dá)53-54
• 2.4 討論54-56
• 2.5結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文和成果63-64
• 致謝64

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2 侯s

本文編號(hào)：350534