本文關鍵詞：大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位的原核表達及其初步應用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：大腸桿菌不耐熱腸毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin,LT)是分泌到細胞周質(zhì)的一種熱不穩(wěn)定腸毒素,它由A、B兩個亞單位組成,能導致旅行者和豬等家畜的嚴重腹瀉,目前還沒有預防此疾病的有效疫苗。LT不僅具有很強的黏膜免疫原性,還擁有較強的黏膜免疫佐劑效應。由于LTA的毒副作用限制了其應用,我們將無毒性的B亞單位作為研究對象。我們試圖通過制備LTB重組蛋白,研究其作為疫苗預防幼畜腹瀉的可能性,并將其與減毒沙門氏菌疫苗共同免疫BALB/c小鼠,以研究其黏膜免疫佐劑效應。研究目的：研究LTB作為疫苗預防幼畜腹瀉的可能性；研究LTB作為黏膜免疫佐劑對減毒沙門氏菌疫苗的佐劑效應。研究方法：查閱GenBank中公布的LTB基因序列,利用軟件設計引物,PCR擴增LTB目的基因,載體質(zhì)粒pCold-TF和PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后,將回收的載體和LTB片段用T4連接酶連接,構(gòu)建pCold-TF/LTB重組質(zhì)粒,對重組質(zhì)粒進行鑒定。將pCold-TF/LTB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21,接著用IPTG進行低溫過夜誘導表達,取上清通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證后再通過His標簽親和純化,獲得可溶性蛋白TF/LTB,用ELISA對純化后的TF/LTB蛋白進行鑒定。純化的TF/LTB蛋白用來免疫BALB/c小鼠,三免后用間接ELISA法對血清和糞便的IgG和IgA水平進行檢測,并用腸毒素大腸桿菌ETEC K88對免疫后的小鼠進行免疫保護實驗,用來研究LTB作為疫苗預防幼畜腹瀉的可能性。沙門氏菌減毒疫苗與純化的TF/LTB蛋白三免后同樣用間接ELISA法檢測糞便中的IgA水平,用來研究LTB的黏膜免疫佐劑效應。研究結(jié)果：通過PCR成功擴增LTB基因；成功構(gòu)建pCold-TF/LTB重組質(zhì)粒；獲得TF/LTB重組蛋白；TF/LTB作為疫苗預防幼畜腹瀉有一定效果；TF/LTB對沙門氏菌減毒疫苗具有黏膜免疫佐劑效應。研究結(jié)論：重組TF/LTB為預防幼畜腹瀉疫苗的研究提供了有利工具；TF/LTB能夠作為減毒沙門氏菌疫苗的黏膜免疫佐劑。
【關鍵詞】：大腸桿菌不耐熱腸毒素 重組蛋白TF/LTB 表達純化 疫苗 黏膜佐劑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378.21
【目錄】：

• 摘要2-3
• ABSTRACT3-6
• 符號說明6-8
• 第一部分 LTB基因的克隆與原核表達載體的構(gòu)建8-20
• 1 材料8-11
• 2 方法11-16
• 3 結(jié)果16-18
• 4 討論18-19
• 參考文獻19-20
• 第二部分 重組蛋白的表達及其鑒定20-36
• 1 材料20-24
• 2 方法24-29
• 3 結(jié)果29-34
• 4 討論34-35
• 參考文獻35-36
• 第三部分 重組蛋白的初步應用36-46
• 1 材料36
• 2 方法36-38
• 3 結(jié)果38-42
• 4 討論42-44
• 參考文獻44-46
• 綜述46-54
• 參考文獻50-54
• 致謝54-55

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  本文關鍵詞：大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位的原核表達及其初步應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：349751