發(fā)布時間：2021-11-14 18:47

　　目的原核表達及純化帶GST標簽的人類乳頭狀瘤病毒E6相關(guān)蛋白E6AP,為研究泛素化修飾與多種疾病的機制關(guān)聯(lián)提供實驗基礎。方法以人卵巢文庫為模板,利用PCR技術(shù)擴增E6AP編碼序列,將其插入pGEXKG-GST載體中。利用DH5α感受態(tài)細胞鑒定重組質(zhì)粒并大量克隆。質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rossate菌株,小量誘導表達。利用GST融合蛋白純化磁珠提取并純化GST-E6AP融合蛋白,SDS-PAGE電泳和Western印跡檢測純化效率。結(jié)果 PCR技術(shù)成功獲取大小約為2559 bp的E6AP編碼序列,與pGEX-KG-GST載體連接,雙酶切鑒定及公司測序結(jié)果顯示GST-E6AP載體構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)入Rossate菌株后誘導質(zhì)粒小量表達,獲取并提純帶有GST標簽的E6AP重組蛋白。SDS-PAGE電泳和Western印跡結(jié)果顯示E6AP蛋白純化成功。結(jié)論成功構(gòu)建重組質(zhì)粒并表達GSTE6AP蛋白,獲取純化E6AP蛋白,為進一步研究泛素化在疾病發(fā)生發(fā)展中的地位和作用奠定堅實基礎。 

【文章來源】：軍事醫(yī)學. 2019,43(05)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

目的基因E6AP的PCR擴增M.DNA標志物（BM15000）；

肗coⅠ和HindⅢ雙酶切目的基因片段和載體，T4連接酶將目的基因與載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細胞，通過氨芐青霉素篩選，獲得成功轉(zhuǎn)入載體的單克隆活化菌株。菌液PCR進一步篩選連接目的基因條帶的菌株（圖2）。提取質(zhì)粒進行NcoⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，可見約2559bp的目的基因條帶和對照pGEXKGGST載體條帶（圖3）。結(jié)果證明，E6AP編碼序列已與pGEXKGGST載體連接，并成功轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細胞。質(zhì)粒送測序，結(jié)果表明，目的基因的序列與預期一致，無突變位點。圖2重組質(zhì)粒GST-E6AP的菌液PCR鑒定M.DNA標志物（BM15000）；1~4.挑取的不同菌落；P.陽性對照；N.陰性對照22.3重組質(zhì)粒GSTE6AP的小量誘導表達GSTE6AP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rossate菌株，挑取單克隆菌落并活化，加IPTG誘導蛋白小量表達。考馬斯亮藍染色和Western印跡檢測誘導前后細菌的融合蛋白表達含量�？捡R斯亮藍染色結(jié)果顯示，經(jīng)誘導后的Rossate菌株大量表達GSTE6AP融合蛋白（圖4）。Western印跡進一步驗證了GSTE6AP融合蛋白成功表達（圖5）。E6AP蛋白相對分子質(zhì)量約為100×103，由于連接GST標簽，GSTE6AP融合蛋白相對分子質(zhì)量偏大，符合預期。圖3重組質(zhì)粒GST-E6AP的酶切鑒定M.DNA標志物（BM15000）；1.GST空載體+NcoⅠ+HindⅢ；2.GSTE6AP+NcoⅠ+HindⅢ圖4GST-E6AP融合蛋白的SDS-PAGE分析M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標志物；Pre.GSTE6AP誘導前；Post.GSTE6AP誘導后，箭頭表示目的蛋白條帶圖5GST-E6AP融合蛋白的Western印跡分析Pre.GSTE6AP誘導前；Post.GSTE6AP誘導后22.4融合蛋白GSTE6AP的純化

陽性對照；N.陰性對照22.3重組質(zhì)粒GSTE6AP的小量誘導表達GSTE6AP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rossate菌株，挑取單克隆菌落并活化，加IPTG誘導蛋白小量表達�？捡R斯亮藍染色和Western印跡檢測誘導前后細菌的融合蛋白表達含量�？捡R斯亮藍染色結(jié)果顯示，經(jīng)誘導后的Rossate菌株大量表達GSTE6AP融合蛋白（圖4）。Western印跡進一步驗證了GSTE6AP融合蛋白成功表達（圖5）。E6AP蛋白相對分子質(zhì)量約為100×103，由于連接GST標簽，GSTE6AP融合蛋白相對分子質(zhì)量偏大，符合預期。圖3重組質(zhì)粒GST-E6AP的酶切鑒定M.DNA標志物（BM15000）；1.GST空載體+NcoⅠ+HindⅢ；2.GSTE6AP+NcoⅠ+HindⅢ圖4GST-E6AP融合蛋白的SDS-PAGE分析M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標志物；Pre.GSTE6AP誘導前；Post.GSTE6AP誘導后，箭頭表示目的蛋白條帶圖5GST-E6AP融合蛋白的Western印跡分析Pre.GSTE6AP誘導前；Post.GSTE6AP誘導后22.4融合蛋白GSTE6AP的純化利用GST珠對GSTE6AP融合蛋白進行純化，考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示，GSTE6AP融合蛋白純化成功（圖6）。UV法檢測純化后蛋白，純度以D280/354


本文編號：3495162