發(fā)布時間：2021-11-09 11:50

　　破骨細(xì)胞分化因子（osteoclast differentiation factor，ODF）是近年來新發(fā)現(xiàn)的重要的骨代謝調(diào)節(jié)因子，它已經(jīng)成為代謝性骨病領(lǐng)域的研究熱點。ODF作用復(fù)雜，無論在正常的生理狀態(tài)下，還是在異常的病理狀態(tài)下，其效應(yīng)實現(xiàn)的途徑，效應(yīng)的調(diào)節(jié)等機制尚未完全闡明。用基因工程制備大量的ODF，可以為進一步的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 本研究選擇了具有功能活性的人ODF可溶片段（aa 145-317）cDNA，分別在大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞中進行了克隆表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)操作簡便，能夠快速獲得蛋白，可制備相應(yīng)的抗體。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的蛋白有優(yōu)良活性，可以滿足功能研究的需要。 在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，PCR擴增人ODF可溶片段cDNA，然后將擴增片段插入到原核表達(dá)載體pET42a的多克隆位點——PshA Ⅰ酶切位點處，構(gòu)建為重組融合表達(dá)載體pET42a／ODF。經(jīng)酶切和測序鑒定后，重組融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E．Coli BL21（DE3）進行表達(dá)。超聲裂解細(xì)菌，SDS-PAGE鑒定裂解物中是否含有重組融合ODF蛋白。Western Blot鑒定融合蛋白是否具有免疫原性。 在... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒KPnl酶切圖1一5孟組質(zhì)粒Hindm醉切

融合蛋白轉(zhuǎn)膜后經(jīng)顯色，與蛋白分子量比較，可見一條略大于43KDa的條帶，其位置與重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)膜后氨基黑染色的特異性條帶位置相一致(圖1一7，5道)。說明重組蛋白確系ODF融合蛋白。

，{{{{{{’x1osxm’兵兵兵一一一-」里堅一一-一一一圖1一8本試驗采用表達(dá)宿主E.。。LiBL21(OE3)和pET質(zhì)粒的表達(dá)控制PshA工單酶切進行操作，和雙酶切的定向連接比，簡化了操作，降低了載體的損失，但是PshAI酶切產(chǎn)物為平端切口，且試驗中連接反應(yīng)直接使用5’端沒有磷酸基團的PCR產(chǎn)物，酶切后的載體不能去磷酸化，使連接效率減低，載體的自連機率加大。為了增加連接的成功機率，采取如下措施(1)適當(dāng)增加連接反應(yīng)液的體積以增加目的片段和載體的濃度:(2)提高連接溫度以利連接酶發(fā)揮最大的效率:(3)適當(dāng)延長連接反應(yīng)的時間;(4)轉(zhuǎn)化宿主菌時，用豐富營養(yǎng)培養(yǎng)基SOC預(yù)培養(yǎng)。結(jié)果一次性順利連接成功，在15個轉(zhuǎn)化菌落中篩選到一個正向連接的重組子。表達(dá)外源蛋白時，宿主菌生長4小時，誘導(dǎo)4小時后超聲碎菌

【參考文獻】：
期刊論文
[1]利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的研究進展[J]. 畢永春.  國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊). 2001(05)

碩士論文
[1]重組谷氨酸脫羧酶（GAD）在BL-21細(xì)胞中的表達(dá)及條件優(yōu)化[D]. 油紅捷.天津醫(yī)科大學(xué) 2002



本文編號：3485277