本文關(guān)鍵詞：傷寒沙門菌非編碼RNA AsrH驗(yàn)證與表型研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:近來,本研究組通過對傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)轉(zhuǎn)錄組的分析,新發(fā)現(xiàn)了很多非編碼RNA(non-coding RNA,nc RNA),其中有一可能為rpo H基因?qū)?cè)編碼的nc RNA,稱為Asr H,本論文擬進(jìn)行Asr H表達(dá)鑒定和分子特性分析,觀察其在S.Typhi中的作用。方法:1.Asr H的鑒定:通過Northern Blot證實(shí)Asr H在S.Typhi中的存在性,并通過Northern Blot和q RT-PCR觀察其生長時(shí)相的表達(dá)特性。2.Asr H的分子全長鑒定:通過5′RACE、Tiling PCR來找出Asr H的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)、可能的轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn),測出Asr H分子的大概全長。3.基因缺陷變異株的制備:通過自殺質(zhì)粒p GMB151介導(dǎo)構(gòu)建S.Typhi asr H基因啟動子缺陷變異株。4.asr H變異株的半定量驗(yàn)證:用RT-PCR分析S.Typhi野生株(簡稱“WT”)和asr H變異株中asr H和rpo H的表達(dá)情況。5.生長曲線測定:描制生長曲線,觀察WT、asr H基因啟動子缺陷株在四種不同環(huán)境下(等滲、高滲應(yīng)激、氧應(yīng)激、酸應(yīng)激)時(shí)的生存情況。6.動力試驗(yàn):半固體動力培養(yǎng)板(0.3%)上培養(yǎng)細(xì)菌,觀察比較asr H啟動子缺陷變異株、WT的動力情況。7.生物膜形成試驗(yàn):生物膜結(jié)晶紫染色觀察asr H啟動子缺陷變異株、WT的生物膜形成情況。結(jié)果:1.Northern blot與q RT-PCR表明Asr H在S.Typhi中確實(shí)存在,而且在生長對數(shù)晚期(OD600=1.2)的時(shí)候表達(dá)量最高。2.經(jīng)過5′RACE和Tiling PCR分析,推斷Asr H分子全長在846bp-1007bp之間,轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于rpo H基因終止碼下游119bp,轉(zhuǎn)錄方向相反,能覆蓋大部分的rpo H基因編碼區(qū),中間沒有完整的ORF結(jié)構(gòu),因此Asr H為一長非編碼RNA。3.自殺質(zhì)粒p GMB151介導(dǎo)敲制asr H基因啟動子區(qū)域缺失120bp的變異株。4.在asr H缺陷株中asr H基因不表達(dá),rpo H基因正常表達(dá)。在WT中asr H和rpo H基因兩者都表達(dá)。5.生長曲線顯示,在一定時(shí)間內(nèi),與WT相比,酸、高滲應(yīng)激下asr H缺陷株的生存能力顯著降低,而在氧應(yīng)激下則相反。6.動力試驗(yàn)顯示,與WT相比,asr H啟動子缺陷株的動力幾乎完全喪失。7.生物膜顯示,asr H啟動子缺陷株生物膜形成能力強(qiáng)于WT。結(jié)論:證實(shí)了nc RNA Asr H在S.Typhi中的存在表達(dá),Asr H分子大概全長在846bp-1007bp之間。Asr H能影響S.Typhi在應(yīng)激環(huán)境下的生存能力,且對細(xì)菌的動力至關(guān)重要,而對與生物膜的形成有抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：傷寒沙門菌 AsrH 生物膜 動力 生長曲線
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378.22
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 英文縮略語12-13
• 1 緒論13-17
• 1.1 傷寒沙門菌簡介13-14
• 1.2 細(xì)菌中的非編碼RNA14-15
• 1.3 S. Typhi中的非編碼RNA的研究15-16
• 1.4 本課題研究由來16-17
• 2 本文研究目的、內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)路線17-20
• 2.1 研究目的17
• 2.2 研究內(nèi)容17
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及路線17-20
• 2.3.1 S. Typhi中ncRNA AsrH驗(yàn)證及結(jié)構(gòu)初步分析17-18
• 2.3.2 S. Typhi中ncRNA AsrH表達(dá)特性分析18
• 2.3.3 S. Typhi中ncRNA AsrH作用初步研究18-20
• 3 實(shí)驗(yàn)材料與方法20-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 3.1.1 菌株和質(zhì)粒20
• 3.1.2 主要試劑20
• 3.1.3 主要溶液20-22
• 3.1.4 主要儀器22
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法22-43
• 3.2.1 S. Typhi培養(yǎng)22-23
• 3.2.2 細(xì)菌總RNA的提取23
• 3.2.3 Northern blot分析S. Typhi中ncRNA Asr H的表達(dá)23-25
• 3.2.4 qRT-PCR分析S. Typhi中ncRNA AsrH的表達(dá)25-26
• 3.2.5 S. Typhi中ncRNA AsrH的分子全長鑒定26-34
• 3.2.6 S. Typhi中asrH基因啟動子缺陷變異株的敲建及半定量驗(yàn)證34-41
• 3.2.7 非編碼RNA Asr H對傷寒沙門菌表型的影響41-43
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論43-60
• 4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-55
• 4.1.1 傷寒沙門菌非編碼RNA AsrH的Northern Blot和qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果43-45
• 4.1.2 S .Typhi非編碼RNA AsrH的分子全長鑒定45-47
• 4.1.3 S. Typhi asrH基因啟動子缺陷變異株的制備敲建47-53
• 4.1.4 非編碼RNA Asr H對傷寒沙門菌表型的影響53-55
• 4.2 討論55-60
• 5 主要結(jié)論及展望60-61
• 5.1 主要結(jié)論60
• 5.2 展望60-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章68

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