本文關(guān)鍵詞：低氧處理對不同年齡段C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于胚胎早期中胚層和外胚層的多能干細(xì)胞,在體內(nèi)廣泛分布。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具有支持造血、自我更新、多向分化、免疫調(diào)節(jié)、分泌因子等諸多功能,在組織再生、創(chuàng)傷修復(fù)和多種疾病的治療中有巨大潛力。然而由于BMSCs是一群不均一的細(xì)胞群體,其不同亞群的細(xì)胞表面抗原存在著差異。因此目前BMSCs表面標(biāo)志物的篩選尚存爭議。BMSCs具有較強的自我更新能力。BMSCs的生長曲線呈S形,在傳代7代之前具有較好的生長特性。BMSCs具有多向分化能力。在不同的誘導(dǎo)條件下,BMSCs可分化為多種造血以外的組織細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞、星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。此外,BMSCs還發(fā)揮著支持造血、調(diào)節(jié)免疫、分泌某些因子的作用。如轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 (matrix metalloprotein-9, MMP-9)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)等。除了以上這些優(yōu)良特性,BMSCs還易于提取,易于體外擴(kuò)增,易于外源性基因的導(dǎo)入和表達(dá)。因此BMSCs有望成為細(xì)胞治療和基因治療的有力工具。在多種造血以外的缺陷性疾病、退行性疾病、遺傳性疾病的治療中發(fā)揮重要價值。目前,自體干細(xì)胞移植是BMSCs應(yīng)用于臨床的重要手段,它有如下一些優(yōu)勢：一、細(xì)胞源于每個病人自身,供體來源充足；二、無免疫排斥反應(yīng)；三、治療費用相對低廉；四、無倫理學(xué)障礙。支持造血是體內(nèi)BMSCs的主要生理作用之一。有報道稱自體BMSCs和外周血造血干細(xì)胞共移植可用于治療惡性血液病。大量報道證實自體BMSCs移植在骨、軟骨、關(guān)節(jié)等創(chuàng)傷修復(fù)中的良好表現(xiàn)：自體BMSCs與同種異體骨支架復(fù)合可治療犬下頜骨節(jié)段性缺損；自體BMSCs與藻酸鹽載體復(fù)合可治療兔關(guān)節(jié)軟骨缺損；自體BMSCs與生物蛋白膠混合注射有利于兔前交叉韌帶重建的術(shù)后恢復(fù)；自體BMSCs經(jīng)旋骨內(nèi)動脈灌注可用于治療股骨頭缺血性壞死。一些研究發(fā)現(xiàn)自體BMSCs還可用于組織創(chuàng)傷或組織缺損的修復(fù)性治療：自體BMSCs可用于治療裸鼠皮膚創(chuàng)面；自體BMSCs可以幫助重建兔受損的眼表,減輕水腫,抑制血管生成；自體BMSCs可用于進(jìn)行犬膀胱部分切除修補。此外,自體BMSCs在一些缺血缺氧性損傷的治療中亦能發(fā)揮重要作用(盡管其作用機(jī)制尚未非常明確)：自體BMSCs局部注射可用于療小型豬心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI);經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention, PCI)的同時行自體BMSCs冠脈灌注可以抑制AMI患者的左心室重構(gòu),改善心功能；自體BMSCs局部注射可以改善下肢缺血的血流灌注；自體BMSCs可改善糖尿病足的局部癥狀。自體BMSCs亦可用于神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)：自體BMSCs靜脈注射可改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)功能障礙的癥狀；經(jīng)靜脈自體BMSCs移植可用于治療腦梗死；自體BMSCs血腫腔內(nèi)沖洗有助于腦出血的術(shù)后恢復(fù)；自體BMSCs可用于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)的治療；自體BMSCs可以用于周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)；自體BMSCs聯(lián)合外周神經(jīng)移植術(shù)可用于治療脊髓損傷。然而,由于功能性神經(jīng)元不僅要具備典型神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)特征和特異性標(biāo)記,還應(yīng)該具備可興奮性、形成突觸聯(lián)系的能力、產(chǎn)生突觸電位的能力等。因此,BMSCs的神經(jīng)方向誘導(dǎo)是否成功尚存在很大的爭議。但是自體BMSCs在不同器官多種原因引起的功能障礙中也能夠發(fā)揮治療作用：自體BMSCs可用于治療豬急性肝功能衰竭；自體BMSCs移植可促進(jìn)肝硬化SD大鼠模型殘余肝臟再生；自體BMSCs可以緩解異基因小型豬的肝移植急性排斥反應(yīng)；自體BMSCs移植可用于治療終末期肝��；自體BMSCs移植可以促進(jìn)兔缺血再灌注損傷后腎臟功能的恢復(fù)和組織結(jié)構(gòu)的修復(fù)；自體BMSCs移植可以在急性重癥胰腺炎早期保護(hù)大鼠免受損害；自體BMSCs移植聯(lián)合胰島素或降糖藥治療能有效降低患者血糖,并改善患者諸多臨床癥狀。自體BMSCs移植是充分發(fā)揮BMSCs強大的組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、支持造血等功能的有效手段。因此,有很多學(xué)者致力于將BMSCs應(yīng)用于更廣泛的治療領(lǐng)域。然而自體BMSCs移植受供體年齡的影響很大,隨著人類年齡的增長,BMSCs也隨之發(fā)生著生理性老化。氧化應(yīng)激理論認(rèn)為,隨著人類年齡的增長,機(jī)體抗氧化系統(tǒng)失衡。隨著大量活性氧的釋放和積累,細(xì)胞逐漸老化甚至凋亡,對應(yīng)的就是器官的衰退甚至衰竭。BMSCs也難逃這樣的規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn),胚胎BMSCs,增殖能力較強,體外培養(yǎng)時無接觸性抑制,但是分泌功能較差。而在成體BMSCs中,0-20歲之間的BMSCs生物學(xué)特性最優(yōu)。因此,是良好的BMSCs來源。有人認(rèn)為氧化應(yīng)激學(xué)說并不能完美地解釋細(xì)胞老化現(xiàn)象,我們或許能夠找到一種能改善老化個體BMSCs生物學(xué)特性的方法。低氧處理對BMSCs的作用是一個有趣的課題。它似乎給人們提供了一點希望。有人推測由于骨髓里的氧濃度低于其他組織,所以低氧環(huán)境更利于BMSCs的生長。一些實驗證實：3%02的持續(xù)性低氧可促進(jìn)人BMSCs的增殖；1%02的持續(xù)性低氧可促進(jìn)人BMSCs增殖,促進(jìn)集落形成,促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1α)的表達(dá),促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的分泌,抑制BMSCs的成骨分化。但是也有相反的結(jié)論：低氧可促進(jìn)含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的BMSCs增殖,但是在無血清條件下則表現(xiàn)為抑制增殖；1%02濃度是非致死性條件,但是可短暫抑制大鼠BMSCs的增殖。因此,人們認(rèn)為低氧處理對BMSCs的作用與氧濃度大小、作用持續(xù)時間、培養(yǎng)基中的血清濃度、物種等多種因素相關(guān)。目的：適度的低氧處理可能會促進(jìn)BMSCs的增殖。我們計劃在C57小鼠BMSCs上重復(fù)這種處理,并且將這種處理應(yīng)用于增殖能力差的老化C57小鼠BMSCs上,以期促進(jìn)其增殖。方法：我們參考Billups-rothenberg公司的MIC101型細(xì)胞低氧培養(yǎng)系統(tǒng),并作了相應(yīng)改進(jìn)。自制了一套新型低氧培養(yǎng)裝置。這種裝置的設(shè)計原理是從普通培養(yǎng)箱中引入的含5% CO2的混合氣體作為氣體來源,在“活性鐵—蛭石—活性炭原電池”消耗了其中的O2之后再供給BMSCs。和MIC101型細(xì)胞低氧培養(yǎng)系統(tǒng)相比,這種裝置無需連接鋼制氣瓶,使用時靈活方便安全可靠。這種裝置可以保證氣體的充分交換,保證測氧儀檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。這種裝置可以在降低O2濃度的同時,維持CO2濃度的穩(wěn)定。根據(jù)The Jackson Laboratory提供的數(shù)據(jù),C57小鼠出生后3-6周相當(dāng)于人類的20-30歲,C57小鼠出生后18-24個月相當(dāng)于人類的56-69歲。我們選取3-6周C57小鼠作為年輕組,選取18-24個月C57小鼠作為老齡組。全骨髓法獲取3-6周年輕組C57小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),通過換液、傳代等方法體外擴(kuò)增至第6代。并且選取了其中部分細(xì)胞進(jìn)行凍存。取第6代年輕組C57小鼠的BMSCs作常規(guī)培養(yǎng),于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目,繪制連續(xù)5天的細(xì)胞生長曲線,以證實年輕組C57小鼠的BMSCs的增殖能力較強。取第6代年輕組C57小鼠的BMSCs作成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo),以證實年輕組C57小鼠的BMSCs的仍然具有良好的多向分化能力,證實全骨髓法獲取C57小鼠BMSCs的可行性。取第6代年輕組C57小鼠的BMSCs于5%02低氧下處理30min,繼而常規(guī)孵育8h。然后用結(jié)晶紫染色,于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目的變化。全骨髓法獲取18-24個月老化C57小鼠骨髓貼壁細(xì)胞作原代培養(yǎng)。于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目,繪制連續(xù)12天的細(xì)胞生長曲線。以證實隨著年齡的增殖,BMSCs的增殖能力減弱。全骨髓法獲取老化C57小鼠的BMSCs較為困難。取接種后72h的老化C57小鼠的骨髓貼壁細(xì)胞于5%02低氧下處理30min,繼而常規(guī)培養(yǎng)24h,并用結(jié)晶紫染色,于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目的變化。結(jié)果：3-6周年輕組C57小鼠BMSCs,可體外擴(kuò)增至第6代,并且保持了多向分化能力。經(jīng)5%02低氧下處理30min后,呈片狀脫落。18-24個月老化C57小鼠的骨髓貼壁細(xì)胞增殖能力差,經(jīng)12天的原代培養(yǎng)僅形成了一個集落。經(jīng)5%O2低氧下處理30min,并繼續(xù)培養(yǎng)24h后,貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少,且無新的集落形成。結(jié)論：利用全骨髓法可順利地獲取的年輕組C57小鼠的BMSCs。第6代年輕組C57小鼠BMSCs生長良好,并保持了多向分化能力。但低氧處理可損害年輕組的C57小鼠BMSCs的增殖。利用全骨髓法獲取老化C57小鼠BMSCs較為困難,低氧處理可損害老化C57小鼠骨髓貼壁細(xì)胞的原代培養(yǎng)。
【關(guān)鍵詞】：低氧處理 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 第1章 前言17-25
• 1.1 BMSCs的生物學(xué)特性17-18
• 1.2 自體BMSCs在實驗室和臨床上的廣泛嘗試18-23
• 1.3 細(xì)胞生理性老化對應(yīng)用自體BMSCs進(jìn)行移植的限制23-24
• 1.4 低氧處理對BMSCs的作用24-25
• 1.5 本實驗的研究內(nèi)容25
• 第2章 儀器與耗材25-27
• 2.1 實驗所用儀器25-26
• 2.2 實驗所用試劑26-27
• 2.3 常用試劑的配制27
• 2.3.1 油紅“O”的配制27
• 2.3.2 0.1%茜素紅的配制27
• 2.3.3 0.01%PBS緩沖液的配制27
• 2.3.4 DMEM的配制27
• 2.3.5 完全培養(yǎng)基的配制27
• 第3章 實驗技術(shù)和實驗方法27-44
• 3.1 實驗動物的選擇28
• 3.2 低氧裝置的制作和使用28-33
• 3.2.1 低氧裝置的制作28-30
• 3.2.2 低氧裝置中各種氣體組分的變化及其換算30-32
• 3.2.3 低氧裝置的使用方法32-33
• 3.3 C57小鼠BMSCs的原代培養(yǎng)33-35
• 3.3.1 年輕組C57小鼠BMSCs的原代培養(yǎng)方法33-34
• 3.3.2 老齡組C57小鼠BMSCs的原代培養(yǎng)方法34-35
• 3.4 細(xì)胞的全量換液和半量換液35-36
• 3.4.1 細(xì)胞的全量換液35
• 3.4.2 細(xì)胞的半量換液35-36
• 3.5 年輕組C57小鼠BMSCs的傳代36-38
• 3.5.1 年輕組C57小鼠BMSCs的普通傳代法36-37
• 3.5.2 年輕組C57小鼠BMSCs的多次消化傳代法37-38
• 3.6 年輕組C57小鼠BMSCs的凍存38-39
• 3.7 年輕組C57小鼠BMSCs的復(fù)蘇39-40
• 3.8 各年齡組C57小鼠BMSCs的低氧處理方法40
• 3.8.1 年輕組C57小鼠BMSCs的低氧處理40
• 3.8.2 老齡組C57小鼠BMSCs的低氧處理40
• 3.9 各年齡組C57小鼠BMSCs的結(jié)晶紫染色40-41
• 3.10 年輕組C57小鼠BMSCs的誘導(dǎo)分化41-43
• 3.10.1 年輕組C57小鼠BMSCs的成骨誘導(dǎo)41-42
• 3.10.2 年輕組C57小鼠BMSCs的成脂誘導(dǎo)42-43
• 3.11 細(xì)胞計數(shù)和統(tǒng)計學(xué)分析43-44
• 第4章 結(jié)果44-49
• 4.1 年輕組C57小鼠BMSCs增殖能力強且具有成骨、成脂能力44-45
• 4.2 低氧處理對年輕組C57小鼠BMSCs的培養(yǎng)不利45-47
• 4.3 老齡組C57小鼠BMSCs的原代培養(yǎng)較為困難47-48
• 4.4 低氧處理對老齡組C57小鼠BMSCs的培養(yǎng)不利48-49
• 第5章 討論49-50
• 第6章 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果57-58
• 中英文符號對照說明表58-60
• 致謝60-62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：340638