本文關(guān)鍵詞：蛋白激酶SRPK2在小鼠睪丸組織的表達(dá)特征及初步功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:明確絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase 2,srpk2)m RNA及編碼蛋白產(chǎn)物在小鼠睪丸組織不同細(xì)胞中的差異表達(dá)特征;進(jìn)一步運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建srpk2的真核表達(dá)質(zhì)粒并建立srpk2過表達(dá)HEK293T細(xì)胞模型;分析srpk2過表達(dá)對HEK293T細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響,及其與微管結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系,為深入探討該基因在精子發(fā)生中的作用及意義奠定基礎(chǔ)。方法:1.利用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR)分析小鼠睪丸組織四種細(xì)胞系中srpk2基因m RNA的差異表達(dá);2.利用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blotting)分析小鼠睪丸組織四種細(xì)胞系中srpk2基因編碼蛋白產(chǎn)物的表達(dá);3.應(yīng)用免疫組化和免疫熒光技術(shù)檢測SRPK2蛋白在小鼠睪丸組織的細(xì)胞定位;4.通過免疫熒光雙重染色觀察SRPK2蛋白和α-Tubulin蛋白在生精細(xì)胞中的定位分布;5.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建srpk2真核表達(dá)重組質(zhì)粒p LV-EGFP(2A)Puro-srpk2;6.采用RT-PCR和Western blotting檢測重組質(zhì)粒p LV-EGFP(2A)Puro-srpk2轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后srpk2 m RNA和蛋白的表達(dá)水平;7.通過CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測過表達(dá)srpk2后HEK293T細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期變化;8.采用間接免疫熒光雙重染色檢測SRPK2蛋白和α-Tubulin蛋白在HEK293T細(xì)胞中的定位分布;9.采用Western blotting檢測srpk2過表達(dá)對聚合態(tài)和未聚合態(tài)微管蛋白影響。結(jié)果:1.實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示srpk2在小鼠精母細(xì)胞(GC2-spd)、小鼠支持細(xì)胞Sertoli(TM4)、小鼠間質(zhì)細(xì)胞Leydig(TM3)中的表達(dá)水平相近,而在小鼠精原細(xì)胞(GC1-spg)中的表達(dá)水平較低;2.免疫組化結(jié)果表明SRPK2蛋白在曲精小管中的所有細(xì)胞均有分布,但在精子發(fā)生后期的長形精子細(xì)胞階段相對集中,同時(shí)間質(zhì)細(xì)胞也可見到陽性信號;3.免疫熒光分析顯示SRPK2蛋白定位在精原細(xì)胞的胞漿,精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞的胞漿和胞核都有分布,發(fā)育后期主要集中在長形精子細(xì)胞核附近,在間質(zhì)細(xì)胞定位于胞漿;4.免疫熒光雙重染色結(jié)果顯示SRPK2蛋白與α-Tubulin蛋白在長形精子細(xì)胞核附近存在明顯的共定位關(guān)系;5.DNA測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒p LV-EGFP(2A)Puro-srpk2構(gòu)建成功;6.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后,經(jīng)RT-PCR和Western blotting檢測表明srpk2基因在HEK293T內(nèi)實(shí)現(xiàn)了過表達(dá);7.CCK-8檢測結(jié)果顯示過表達(dá)srpk2組HEK293T細(xì)胞的增殖率明顯高于空載體組及裸細(xì)胞組(P0.05),流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組HEK293T細(xì)胞的G1期明顯降低(P0.05),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;8.細(xì)胞免疫熒光雙重染色分析顯示在HEK293T細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的SRPK2蛋白與α-Tubulin蛋白存在共定位關(guān)系;9.Western blotting結(jié)果表明srpk2過表達(dá)可增加聚合態(tài)微管蛋白含量,而減少未聚合態(tài)微管蛋白含量。結(jié)論:1.srpk2在小鼠睪丸組織精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞Leydig、支持細(xì)胞Sertoli中均有表達(dá),并且SRPK2蛋白與α-Tubulin蛋白存在明顯的共定位關(guān)系;2.成功構(gòu)建了srpk2的真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后,能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖能力,縮短細(xì)胞周期G1期,過表達(dá)SRPK2蛋白與α-Tubulin蛋白存在共定位關(guān)系并對微管聚合具有促進(jìn)作用。
【關(guān)鍵詞】：SRPK2 精子發(fā)生 微管 HEK293T細(xì)胞 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R321.1;Q78
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 常用縮寫詞中英文對照表12-13
• 前言13-15
• 第一部分SRPK2在小鼠睪丸組織四種細(xì)胞系的表達(dá)定位15-35
• 1 材料與方法15-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料15-19
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法19-27
• 2 結(jié)果27-33
• 2.1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測srpk2基因mRNA在四種細(xì)胞系的表達(dá)27-28
• 2.2 Western blotting檢測SRPK2蛋白在四種細(xì)胞系的表達(dá)28-29
• 2.3 免疫組織化學(xué)染色檢測SRPK2蛋白在小鼠睪丸組織中的定位29-30
• 2.4 免疫熒光染色檢測SRPK2蛋白在小鼠睪丸組織中的定位30-31
• 2.5 免疫熒光雙重染色檢測SRPK2和α-Tubulin在生精細(xì)胞中的定位31-33
• 3 討論33-34
• 4 結(jié)論34-35
• 第二部分srpk2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對微管的作用35-59
• 1 材料與方法35-47
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料35-37
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法37-47
• 2 結(jié)果47-57
• 2.1 RT-PCR擴(kuò)增srpk2基因47
• 2.2 pMD?19-T-srpk2質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定47-48
• 2.3 真核表達(dá)重組質(zhì)粒pLV-EGFP(2A)Puro-srpk2的構(gòu)建與鑒定48-50
• 2.4 重組質(zhì)粒pLV-EGFP(2A)Puro-srpk2在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)50-52
• 2.5 過表達(dá)srpk2基因?qū)EK293T細(xì)胞的影響52-57
• 3 討論57-58
• 4 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 綜述63-77
• 參考文獻(xiàn)71-77
• 致謝77-78
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果78-79
• 個(gè)人簡歷79

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本文編號：340542