發(fā)布時間：2017-05-01 05:07

  本文關(guān)鍵詞：HSP65-PEAⅠ融合蛋白表達(dá)純化及免疫效果研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：綠膿桿菌是極受關(guān)注的條件致病菌,在食品中毒素殘留引起的食物中毒事件越來越多,其具有多重耐藥性,免疫預(yù)防綠膿桿菌中毒成為了研究的熱點。同時,綠膿桿菌也是燒燙傷表面感染的主要致病菌。其主要致病因子為綠膿桿菌外毒素A(PEA),PEA通過受體結(jié)合亞基與細(xì)胞表面受體相結(jié)合,毒性部分越膜亞基運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi),催化EF-2的核糖基化抑制蛋白合成使靶細(xì)胞死亡。熱休克蛋白65(HSP65)是主要的分子伴侶家族之一,參與蛋白質(zhì)的折疊,防止蛋白變性聚集,促進變性蛋白解聚進行重折疊,維護細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能。本研究采用基因工程手段,將PEA受體結(jié)合亞基(PEAⅠ)與熱休克蛋白65進行融合表達(dá),研制一種抗綠膿桿菌毒素侵襲的有效疫苗。該疫苗不僅具有PEA的高度保守性和免疫原性,還具有熱休克蛋白增強免疫的特點。進一步為防治食源性綠膿桿菌感染、抗燒燙傷病人多器官衰竭的研究奠定了基礎(chǔ)。利用基因工程手段將HSP65-PEAⅠ基因片段經(jīng)HindⅢ和NotⅠ雙酶切后連接到pET-28a載體中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-HHP,導(dǎo)入感受態(tài)E.coli BL21(DE3)細(xì)胞,獲得表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)(pET-28a-HHP),經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白HHP,摸索純化工藝獲得最佳純化條件,最終得到純度為90%的HHP純品。以HHP為免疫原,建立小鼠免疫試驗?zāi)Ｐ?檢測抗體效價水平,初步評價免疫效果。優(yōu)化并確定最佳免疫程序,為建立燒燙傷感染多器官衰竭動物模型免疫保護實驗奠定基礎(chǔ)。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-HHP,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確后,測序結(jié)果顯示:基因片段HSP65-PEAⅠ正確克隆到pET-28a載體中,表達(dá)的重組蛋白相對分子質(zhì)量約為97000Da,以包涵體形式表達(dá),對包涵體洗滌、變性以及復(fù)性工藝進行優(yōu)化后,最佳的條件為:2%TritonX-100和2M Urea依次洗滌,8M Urea變性裂解,逐步透析至尿素的終濃度為0.5M完成復(fù)性�？扇苄问降鞍譎HP進一步純化工藝為:樣品經(jīng)Q陰離子交換層析---SephadexTM G-25 Fine層析---金屬螯合層析(Cu2+),獲得濃度為0.5 mg/mL,純度達(dá)90%以上的HHP。在用HHP蛋白對小鼠免疫的一周后檢測到特異性抗體,抗體效價水平持續(xù)增長且在42天均達(dá)到了1:210以上,其中鋁鹽佐劑組產(chǎn)生的抗體滴度最高。免疫動物攻毒保護實驗結(jié)果顯示:鋁鹽佐劑組攻毒保護率最高,對3×LD50劑量毒素保護率高達(dá)100%,對5×LD50劑量毒素保護率為80%。最終確定最佳免疫程序為:免疫制劑為20μgHHP蛋白與鋁鹽佐劑1:1(v:v)混合,免疫的第49d抗體滴度達(dá)到1:212,對實驗鼠進行PEA攻毒,能夠耐受3×LD50攻毒劑量,對5×LD50攻毒保護率高于80%。在本研究中,成功改造后的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-HHP在大腸桿菌中高效表達(dá)蛋白HHP,具有組氨酸標(biāo)簽,純化工藝流程簡單,耗時短,純度高,適用于中試規(guī)模進行生產(chǎn)。制備的抗PEA免疫制劑表現(xiàn)出較強的免疫原性,能夠保護機體耐受毒素攻擊,為治療與預(yù)防綠膿桿菌食物中毒、進一步發(fā)開應(yīng)用于臨床的抗綠膿桿菌感染的免疫制劑奠定堅實基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：綠膿桿菌外毒素A 熱休克蛋白65 純化 免疫程序
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 1 前言9-19
• 1.1 綠膿桿菌研究概述9-12
• 1.2 熱休克蛋白研究概述12-18
• 1.3 研究內(nèi)容18
• 1.4 研究目的與意義18
• 1.5 創(chuàng)新點18-19
• 2 材料與方法19-32
• 2.1 材料19-21
• 2.2 方法21-32
• 3 結(jié)果與分析32-41
• 3.1 鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-HHP32-33
• 3.2 重組蛋白HHP表達(dá)SDS-PAGE分析結(jié)果33
• 3.3 包涵體洗滌條件的優(yōu)化33-34
• 3.4 Q SepharoseTM High Performance陰離子交換層析34
• 3.5 金屬螯合層析（Cu2+）34-35
• 3.6 抗體效價測定結(jié)果35
• 3.7 動物攻毒劑量測定及LD50測定結(jié)果35-36
• 3.8 攻毒保護實驗結(jié)果36-37
• 3.9 PEA經(jīng)陰離子交換層析純化結(jié)果37-38
• 3.10 Western blot檢測純化后的PEA38
• 3.11 抗原SEB-HSP65、PEA、HHP的抗體滴度比較結(jié)果38-39
• 3.12 優(yōu)化后的免疫程序抗體效價測定結(jié)果39
• 3.13 優(yōu)化后的免疫程序的攻毒保護實驗結(jié)果39-41
• 4 討論41-43
• 4.1 表達(dá)系統(tǒng)的選擇41
• 4.2 洗滌包涵體條件的優(yōu)化41
• 4.3 蛋白層析的選擇41-42
• 4.4 抗原特異性的確定42
• 4.5 免疫程序的建立與優(yōu)化42-43
• 5 結(jié)論43-45
• 5.1 成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-HHP43
• 5.2 確定最佳包涵體復(fù)性條件43
• 5.3 獲得高純度重組蛋白HHP43
• 5.4 免疫動物產(chǎn)生高滴度抗體43
• 5.5 免疫動物能夠抵抗高劑量毒素攻擊43-44
• 5.6 確定最佳免疫程序44-45
• 參考文獻45-51
• 作者簡介51-52
• 致謝52

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳長征,段治軍,楊新穎,夏其昌,李伯良,王應(yīng)睞;T7啟動子控制下的多功能大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報;1996年05期

  本文關(guān)鍵詞：HSP65-PEAⅠ融合蛋白表達(dá)純化及免疫效果研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：338268