本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌XQ株生物學(xué)特性及毒力變異機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),是一種重要的人畜共患病原菌,可引起多種疾病,危害人和動(dòng)物健康。作為一種條件性致病菌,金葡菌的微生物病原特性非常復(fù)雜,其致病性與菌株毒力因子的表達(dá)密切相關(guān)。金葡菌的毒力因子包括一些能夠破壞宿主細(xì)胞的外毒素以及與黏附和抵御宿主防御相關(guān)的分子,這些毒力因子的表達(dá)受多種調(diào)節(jié)因子的調(diào)控。1984年,在金葡菌中發(fā)現(xiàn)的Agr(Acessory gene regulator)二元調(diào)控系統(tǒng),使人們對金葡菌的毒素調(diào)控有了新的認(rèn)識。該系統(tǒng)由P2和P3兩個(gè)操縱子組成,分別控制RNAII和RNAIII的轉(zhuǎn)錄。RNAII包含AgrA、AgrB、AgrC和AgrD4個(gè)開放閱讀框,AgrD為信號分子前體,經(jīng)AgrB加工處理后,形成有活性的自誘導(dǎo)肽(Autoinducing peptides,AIPs),分泌到胞外,AgrC為一種受體組氨酸蛋白激酶,可識別并結(jié)合同源的AIPs,使Agr C發(fā)生自磷酸化而被激活,進(jìn)而磷酸化并激活效應(yīng)分子Agr A,后者作為轉(zhuǎn)錄因子,可直接調(diào)控如酚溶解小肽PSM-α和-β等毒力因子表達(dá),也可促進(jìn)Agr系統(tǒng)P2和P3操縱子的轉(zhuǎn)錄;P3操縱子主要控制RNAIII的表達(dá),除編碼δ-溶素外,調(diào)節(jié)70多個(gè)基因的表達(dá),包括30多個(gè)已知的金葡菌毒力基因。由于金葡菌存在多種多樣的表型,各種表型之間的致病性也不盡相同。根據(jù)金葡菌七個(gè)看家基因的多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing,MLST),已發(fā)現(xiàn)2957種不同ST型別的金葡菌。不同國家和地區(qū)流行的金葡菌主要ST克隆型別不一,致病性差異也很大。其中,ST121型金葡菌就是一類致病性較強(qiáng)的菌株。2007年,德國Schefold等首次報(bào)道了ST121型金葡菌(spa分型為t284)導(dǎo)致一例51歲患者肺、腎等多器官功能衰竭的病例。Conceicao等的研究證實(shí)ST121型菌株在歐洲國家主要感染兒童,除皮膚、軟組織侵害外,常伴有多種器官的侵襲性損害,致病能力強(qiáng)。我國目前尚未見對ST121型金葡菌致病性的研究報(bào)道。揭示特定型別金葡菌的生物學(xué)特征,毒力以及與之相關(guān)的毒力變異機(jī)制對于后續(xù)的研究具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究以臨床分離的一株致病性較強(qiáng)的ST121型XQ株為研究對象,對其生物學(xué)特性及毒力變異的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.病例報(bào)告及XQ株的分離鑒定xq株分離自我校某附屬醫(yī)院急診科的一位17歲少年男性患者,因“全身風(fēng)團(tuán)伴發(fā)熱,加重伴意識模糊3天”于2012年9月18日入住我校某附屬醫(yī)院急診科,查體:一般情況差,淺昏迷狀,體溫38℃,脈搏150次/分,頭、面部及全身皮膚可見多處膿皰和抓痕;血液檢查示白細(xì)胞10.56×109/l,中性粒細(xì)胞92.6%;胸部正位x片示雙肺斑片狀高密度影,彩超示心包積液;從膿皰、血液和骨髓液中分離培養(yǎng)出革蘭陽性球菌,應(yīng)用美羅培南等抗生素控制感染無效,于9月21日晚10時(shí)死亡。分離的革蘭陽性球菌經(jīng)pcr擴(kuò)增金葡菌特異基因femb、甲氧西林特異耐藥基因meca以及金葡菌殺白細(xì)胞素pvl編碼基因等進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果顯示其為一株femb陽性、meca陰性、pvl陽性金黃色葡萄球菌,命名為xq株。同時(shí)我們對該案例進(jìn)行了報(bào)道(revmedmicrobiol,2015)。2.xq株的分子分型通過一些常用的金葡菌分子分型方法對xq株進(jìn)行分析,主要包括脈沖場凝膠電泳(pulsedfieldgelelectrophoresis,pfge)、多位點(diǎn)序列分析(multilocussequencetyping,mlst)、金黃色葡萄球菌表面蛋白a(staphylococalproteina,spa)可變區(qū)分型(spatyping)以及金葡菌附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)(accessorygeneregulatorsystem,agr)分型等技術(shù)方法對其進(jìn)行分析。pfge技術(shù)是一種分離大分子dna的方法,細(xì)菌染色體經(jīng)酶切后的片段在特定的電泳系統(tǒng)中得到良好的分離。mlst分型方法基于核酸序列測定,以金黃色葡萄球菌的7個(gè)管家基因——arc、aroe、glpf、gmk、pta、tpi、yqil為基礎(chǔ),pcr方法分別擴(kuò)增不同大小的堿基片段,比較多態(tài)性位點(diǎn)的不同,從而得到不同的等位基因譜。葡萄球菌a蛋白(spa),作為一種金葡菌細(xì)胞壁的蛋白組成成分,其x區(qū)基因區(qū)呈多態(tài)性,并含有24bp的可變重復(fù)序列,重復(fù)序列兩端為相對較保守的區(qū)域,這種基因多態(tài)性分型方法即為spa分型。金黃色葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)(agr)是金葡菌的一個(gè)重要的全局調(diào)節(jié)系統(tǒng),根據(jù)agrd和agrc氨基酸序列和長度的多樣性,可以將金葡菌的agr分為四種型別。xq株的分子分型結(jié)果顯示xq株為一株st121型、spat159、agriv金葡菌。3.xq株的基本生物學(xué)特性研究采用血平板對xq株進(jìn)行培養(yǎng),觀察其溶血活性,利用bhi培養(yǎng)基測定其生長曲線,采用balb/c小鼠分別經(jīng)皮下及尾靜脈接種,觀察xq株的毒力。結(jié)果顯示xq株的基本生物學(xué)特性(包括溶血性、生長曲線等)與對照菌atcc25923、rn4220以及n315有所不同,主要表現(xiàn)為溶血性增強(qiáng),生長速率適中。用1×107cfu的xq株和標(biāo)準(zhǔn)株(atcc25923)分別經(jīng)皮下感染小鼠,2周后,前者(xq株)創(chuàng)口出現(xiàn)寬而深的潰瘍,后者(atcc25923)則趨于恢復(fù);用1×105cfu的xq株和標(biāo)準(zhǔn)株atcc25923經(jīng)尾靜脈分別感染小鼠,2天內(nèi)xq株感染組小鼠全部死亡,而atcc25923感染組小鼠7天仍安然無恙,表明xq株具有強(qiáng)致病性。4.xq株的體外連續(xù)傳代及毒力變異為了檢測xq株的毒力是否穩(wěn)定,我們將其在體外lb連續(xù)傳至200代。脈沖場電泳(pfge)顯示xq株的基因組沒有明顯改變,但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明第180代菌株的致病力顯著下降。推測在體外傳代過程中,xq株表達(dá)的毒力因子發(fā)生了改變。對xq和xq180的培養(yǎng)上清進(jìn)行sds-page分析,發(fā)現(xiàn)xq株的上清中有多條高表達(dá)的蛋白質(zhì)主帶,這些高表達(dá)的因子可能與xq株的強(qiáng)致病性密切相關(guān)。將每隔20代菌株的培養(yǎng)上清進(jìn)行sds-page電泳分析,結(jié)果顯示xq株在體外傳20代后的細(xì)菌培養(yǎng)上清的分泌蛋白含量明顯減少,表明xq株發(fā)生了變異,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在第五代的菌株,其培養(yǎng)上清的分泌蛋白譜即發(fā)生了改變。第5代細(xì)菌接種于tsb平板,結(jié)果出現(xiàn)了兩種可穩(wěn)定遺傳的菌落,一種為金黃色,正常大小,另一種為淺黃色,菌落較大。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,金黃色細(xì)菌毒力和xq野生株相似,而淺黃色菌落的毒力明顯減弱,我們將毒力下降的淺黃色菌株命名為xqm株。5.xq株毒力變異的機(jī)制研究xq株與xqm株培養(yǎng)上清的蛋白表達(dá)譜有明顯差異,這可能與xqm株的毒力下降有關(guān),將xq株高表達(dá)的蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果顯示xq株上清蛋白差異的幾條主要條帶為三�；视王ッ�(triacylglycerollipase,76.6kda),pvl(panton-valentineleukocidin,37kda),α-溶血素(alpha-hemolysin,37kda),腸毒素b(superantigenenterotoxinseb,31kda),γ-溶血素(gamma-hemolysin,36kda),葡萄球菌的半胱氨酸蛋白酶(staphylococcalserineproteinasea,sspa,44kda)等,而金葡菌的這些毒力因子的表達(dá)主要受agr系統(tǒng)調(diào)控。xqm株中這些毒力因子表達(dá)的下降是否與其agr系統(tǒng)發(fā)生了變異有關(guān)?為證實(shí)這一假設(shè),我們分別擴(kuò)增了xq株和xqm株的agra、agrb、agrc、agrd基因,并送測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)xqm株的agrc基因第443位插入一段188bp的序列,而該插入序列正好為agrc基因的第255~442之間的序列。進(jìn)一步地采用qrt-pcr檢測了rnaiii、α-溶血素、γ-溶血素、腸毒素b、脂酶等受agr調(diào)控的毒力基因的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些毒力基因的表達(dá)顯著下降,表明xqm株毒力的下降是由于其agr的突變所致。本研究發(fā)現(xiàn)的xqm株agrc基因被自身重復(fù)序列插入而引起的突變尚少見文獻(xiàn)報(bào)道。在課題研究中,我們也試探性地對xq株進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,試圖用基因替換的方法在野生xq株agrc基因中插入本研究發(fā)現(xiàn)的188bp序列,探討插入序列對菌株毒力的影響,但未獲成功,可能由于金葡菌臨床菌株對DNA轉(zhuǎn)化存在多種限制。至于插入序列致agrC基因突變的具體機(jī)制以及agrC基因突變對XQM株毒力的調(diào)控作用還有待進(jìn)一步深入研究。
【關(guān)鍵詞】：金黃色葡萄球菌 生物學(xué)特性 毒力變異 SDS-PAGE 附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R378.11
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-15
• 第一章 前言15-18
• 1.1 選題緣由15
• 1.2 研究背景15-16
• 1.3 研究意義16
• 1.4 研究方法及內(nèi)容16-18
• 第二章 XQ株的生物學(xué)特性研究18-43
• 2.1 材料與方法19-34
• 2.2 結(jié)果34-41
• 2.3 討論41-43
• 第三章 XQ株的毒力變異及機(jī)制探究43-69
• 3.1 材料與方法43-57
• 3.2 結(jié)果57-66
• 3.3 討論66-69
• 全文結(jié)論69-70
• 參考文獻(xiàn)70-76
• 文獻(xiàn)綜述 Staphylococcus aureus ST121: A globally disseminated hypervirulent clone76-98
• References90-98
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果及參與的課題98-99
• 致謝99

【共引文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 白同日格;牛糞堆肥中添加石灰氮對金黃色葡萄球菌的殺滅效果及堆肥發(fā)酵影響的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 張璐;金黃色葡萄球菌毒力基因的分布和致病性的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 凌巍;金黃色葡萄球菌的分布及其腸毒素基因的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

4 索玉娟;食品中金黃色葡萄球菌的分布及其腸毒素基因的研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

5 魏志恒;金黃色葡萄球菌及其溶血素基因分布研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

6 楊軍;鴨源葡萄球菌分離鑒定、毒力基因檢測及與致病性相關(guān)性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

7 徐繼達(dá);食源性金黃色葡萄球菌及其腸毒素基因分布研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

8 王佳;金黃色葡萄球菌毒素基因分布及轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌XQ株生物學(xué)特性及毒力變異機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：339032